In-Cell FPOP gekoppelt mit Massenspektrometrie ist eine leistungsstarke neue Technik, die verwendet wird, um Proteinprotein-Wechselwirkungen und Proteinstrukturveränderungen in lebenden Zellen zu untersuchen. Mit in-Cell FPOP müssen Sie keine proteinorientierten Proteine isolieren, sondern sie in ihrer nativen Umgebung untersuchen. Dies ist besonders hilfreich für Membranproteine.
Mit dieser Methode können Sie Veränderungen in der Struktur und Proteinprotein-Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und genetische Störungen, studieren, so dass Sie sie besser verstehen und charakterisieren können. Um mit der Montage des Strömungssystems zu beginnen, verwenden Sie einen Spaltstein, um die geschmolzenen Kieselsäureschläuche auf die entsprechenden Größen zu schneiden. Als nächstes legen Sie sechs kleine zylindrische Magnete in eine 500-Mikroliter-Spritze und füllen Sie die Spritze, eine zweite 500-Mikroliter-Spritze und zwei Fünf-Milliliter-Spritzen mit Mantelpuffer.
Nach dem Entfernen der Luft legen Sie die Spritzen auf die Spritzenpumpe und ziehen Sie den Spritzenpumpenstopfen so fest, dass die Zellspritze etwa 50 Mikroliter übrig hat, wenn der Motor steht. Schließen Sie mit einem Köderadapter ein manuelles Ventil an jede Spritze an und montieren Sie die Kieselsäureschläuche wie dargestellt, um sicherzustellen, dass die Zelle und die Wasserstoffperoxid-Kieselsäurelinie durch das Kreuz einfädeln und direkt in die 450 ID Kieselsäurelinie einfügen. Wenn alle Schläuche angeschlossen sind, positionieren Sie das Strömungssystem neben einem Laser und verwenden Sie ein Feuerzeug, um die Kieselsäurebeschichtung auf den 450 Mikrometer Innendurchmesser rohren wegzubrennen, um ein Fenster für die Laserbestrahlung zu machen.
Legen Sie einen Magnetrührer über die Zellspritze, die die sechs Magnete enthält, und stellen Sie die Spritzenpumpe auf 492,4 Mikroliter pro Minute für einen Enddurchfluss von 1083,3 Mikroliter pro Minute ein. Durchflusspuffer durch das System dreimal, um das System zu spülen, jede Verbindung auf Lecks zu überprüfen. Verwenden Sie eine konvexe Linse, um den Excimerlaser auf die Kieselsäureschläuche zu fokussieren.
Um das Bestrahlungsfenster zu testen, legen Sie ein kleines Stück Papier hinter die Kieselsäureschläuche und schalten Sie den Laser ein. Messen Sie dann den von der Bestrahlung verbrannten Bereich und verwenden Sie das Bestrahlungsfenster und die Durchflussrate, um die benötigte Laserfrequenz zu berechnen, um einen Ausschlussanteil von Null zu erhalten. Um die Zellen für das Verfahren zu sammeln, waschen Sie die Zellen aus einer 70 bis 90%konfluenten T175-Kolbenkultur mit einer geeigneten Salzlösung in Zellkulturqualität.
Setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter Puffer für das Zählen aus und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Es ist wichtig, die Zellen zu zählen, um sicherzustellen, dass sie für nachgelagerte Analysen ausreichen, aber nicht zu viele, um sie dazu zu bringen, das Strömungssystem zu aggregieren und zu verstopfen. Setzen Sie die Zellen dann mit zwei mal 10 bis sechs Milliliter Mantelpufferkonzentration wieder aus und aliquotieren die Zellen zu einem Volumen von 500 Mikroliterpro-Probe.
Für in-cell FPOP die beiden Fünf-Milliliter-Spritzen mit frischem Mantelpuffer, die 500-Mikroliter-Spritze mit den Magneten mit einem Aliquot von Zellen und die letzte 500-Mikroliter-Spritze mit frisch zubereitetem 200 Millimolaren Wasserstoffperoxid füllen. Schalten Sie den magnetischen Rührer ein und spike in 220 Mikroliter Dimethylsulfoxid zu einem Aliquot von Quench. Legen Sie nach dem sanften Mischen den Quench hinter das Strömungssystem, um die bestrahlten Proben zu sammeln und den Laser einzuschalten.
Schalten Sie nach sieben Sekunden das Durchflusssystem ein. Sobald die Probe mit dem Fließen fertig ist, schalten Sie den Laser aus und mischen Sie den Quench vorsichtig mit der gesammelten Probe. Füllen Sie anschließend alle vier Spritzen mit einem frischen Puffer und spülen Sie den Puffer durch das Durchflusssystem.
Nachdem das System die Spülung beendet hat, wiederholen Sie den Vorgang mit einem neuen Aliquot von Zellen und Lösungen ohne Bestrahlung als keine Lasersteuerung, um die Hintergrundoxidation innerhalb der Zellen zu berücksichtigen. Während die nächste Probe läuft, zentrifugieren Sie die erste Probe und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter eines geeigneten Zelllysepuffers wieder auf. Dann übertragen Sie die Probe in ein Mikrozentrifugenrohr für das Einfrieren von Blitzen in flüssigem Stickstoff.
Wenn alle Proben ausgeführt sind, zerlegen Sie das Durchflusssystem und entsorgen Sie die verwendeten Kieselsäureschläuche. Dann reinigen Sie alle anderen Verbindungen durch Beschallung für eine Stunde in einer 50%Wasser 50%Methanol-Lösung. Nach der Isolierung und Verdauung der Proteine aus der Zelle lysiert nach Standardprotokollen, analysieren Sie das verdaute Zelllysat nach Standard-Tandem-LCMS-Protokollen, um die FPOP-Modifikation protiumweit zu lokalisieren.
Laden Sie die Daten dann in ein entsprechendes Proteinanalyse-Softwareprogramm und analysieren Sie die Daten anhand einer relevanten Proteindatenbank und des relevanten Verdauungsenzyms. Sobald die Dateien die Suche abgeschlossen sind, berechnen Sie das Ausmaß der FPOP-Oxidation auf dem Protein von Interesse. Die Fluoreszenzbildgebung orthogonaler YZ-gestapelter Bilder zeigt eine klare Trennung des Mantelpuffers von der Zelllösung, während er am Laserbestrahlungsfenster vorbeifließt.
Dreidimensionale durchschnittliche Wärmekarten des Mantelpuffers oder der Zelllösung können erstellt werden, um die minimale Durchmischung der beiden Lösungen zu veranschaulichen. Die Verwendung des Einzelzell-Durchflusssystems erhöht die Anzahl der oxidativ modifizierten Proteine um das 13-fache. Um die Veränderung der Proteine von Interesse innerhalb der intakten Zellen zu bestätigen, kann nach Deridoxidbehandlung und Bestrahlung eine Fluoreszenzbildgebung durchgeführt werden.
Mit Hilfe der Tandem-Massenspektrometrie können diese Modifikationen weiter auf bestimmte Aminosäuren auf einem Protein lokalisiert werden. Die in diesem extrahierten Ionenchromatogramm beobachtete Verschiebung übersetzt sich auf die Veränderung der Hydrophobizität, die durch das oxidierte Methionin im modifizierten Peptid verursacht wird. Der Vergleich von in-Zell-labeliertem Aktin durch In-vitro-Fußabdruck zeigt ähnliche Oxidationsraten, was darauf hindeutet, dass Actin eine ähnliche Lösemittel-Zugänglichkeit sowohl für in-Zell- als auch für In-vitro-Studien hat.
Darüber hinaus zeigt der Vergleich des Ausmaßes der schnellen photochemischen Oxidation des Proteins von Interesse Änderungen an der Lösemittel zugänglich, die markierten Rückstände aus zwei Aktin-Kristallstrukturen berechnet zeigt, dass in-Zell schnelle photochemische Oxidation des Proteins von Interesse effizient die Lösungsmittel zugänglich des monomeren Proteins untersucht. Es gibt mehrere zusätzliche Schritte, die man ergreifen kann, um die Erkennung der niedrigeren reichlich vorhandenen FPOP-Modifikationen zu erhöhen, einschließlich 2D-Chromatographie, subzelluläre Fraktionierung und Proteomik-Multiplex-Techniken. Mit der Verwendung von in-Zell-FPOP können wir jetzt proteomyostrukturelle Biologie durchführen, um Proteinstrukturen besser mit der zellulären Funktion zu verbinden.
Aufgrund der 248 Nanometer Wellenlänge, die für FPOP erforderlich ist, sollten Sie immer eine UV-Schutzbrille und die richtige Kleidung tragen, um unbeabsichtigte Exposition gegenüber reflektierter oder gestreuter Strahlung zu vermeiden.
