Unser Zebrafish Xenograft-Arzneimittel-Screening-Workflow ermöglicht die automatisierte Bildgebung und Quantifizierung menschlicher Krebszellen und deren Reaktion auf die medikamentöse Behandlung. Es kann verwendet werden, um schnell die Reaktion einer Geduld Krebszellen auf bekannte Medikamente zu testen oder neue Anti-Krebs-Verbindungen zu identifizieren. Die Verwendung von Zebrafisch-Xenographenmodellen und Medikamentenscreening ermöglicht Inviva-Replikatzahlen, die bisher nur mit In-vitro-Systemen erhältlich waren.
Es ist auch viel kostengünstiger als Mausmodelle beim Screening durch große Bibliotheken von Verbindungen. Dieser Workflow hat mehrere Schritte von der Interjektion von Krebszellen in Zebrafischen bis zur Bildgebung der Arzneimittelreaktion, die am besten durch visuelle Demonstration gelernt werden. Zunächst zentrifugieren Sie mindestens zwei mal 10 bis zu den sechsten Zellen in fünf Millimetern PBS bei 200 mal g für fünf Minuten, und aspirieren Sie den Überstand.
Setzen Sie die Zellpalette in fünf Millimetern Dii-Färbungslösung aus. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vor Licht geschützt. Dann wirbeln Sie sanft und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 15 Minuten vor Licht geschützt.
Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal g und aspirieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter PBS hinzufügen, fünf Minuten lang bei 200 mal g zentrieren und den Überstand anstreuen. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.
Setzen Sie die Zellen in einem Mikroliter PBS pro 250 Tausend lebende Zellen aus und übertragen Sie sie in ein 1,5 Millimeter Mikrozentrifugenrohr. Halten Sie die resuspendierten Zellen im Dunkeln auf Eis. Vor dem Färben von Zellen und Injektionen, machen Agarose Platten für die Injektion durch Gießen 25 Millileiers von drei Prozent Agarose in 1X TBE in eine Petrischale und lassen Sie es zu erstarren.
Bewahren Sie die Teller bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen auf. Auch vor der Färbung von Zellen und Injektionen, entchlorieren Sie zwei Tage nach der Befruchtung Zebrafische mit Zangen unter einem Sezieren Mikroskop. Ziehen Sie von den gegenüberliegenden Enden der schützenden Chorion des Zebrafisches mit Zange, bis der Chorion reißt und der Zebrafisch uneingehüllt wird.
Um das Verklumpen von Zellen während der Mikroinjektion zu verhindern, können Sie nicht fadenförmige Borosilikat-Glasnadeln bei vier Grad Celsius oder auf Eis vorkühlen. Unmittelbar nach der Färbung von Zellen, verwenden Sie eine Mikrolader Pipettenspitze, um fünf Mikroliter von gefärbten Zellen in die gekühlte Nadel zu laden. Laden Sie die Nadel in den Mikroinjektorarm.
Nivellieren Sie die Nadelspitze mit einer sterilen Rasierklinge. Messen Sie mit einem Bühnenmikrometer die Tröpfchengröße in Mineralöl. Halten Sie das Tröpfchenvolumen konstant bei zwei Nanolitern, was einem Durchmesser von etwa 1,5 Millimetern entspricht.
Eine Minute nach der Anästhesie die anästhesierten Larven auf eine vorbereitete flache Injektionsplatte mit drei Prozent Agarose übertragen und die Larven mit einer Pumpe von gebeizten Zellen an der gewünschten Injektionsstelle injizieren. Alle Injektionen sollten innerhalb von ein bis drei Stunden nach der Färbung der Zellen abgeschlossen werden, um klumpende Der Nadel zu verhindern. Waschen Sie die Larven von der Injektionsplatte in eine 10 Zentimeter lange Petrischale mit E3-Medien ohne Methylenblau und brüten Sie bei 28 Grad Celsius für eine Stunde Erholungszeit.
Bewegen Sie die Schale der injizierten Larven in einen 34 Grad Celsius Inkubator. Mit einer leeren Petrischale zwischen dem Regal und der Petrischale von Larven als Puffer zu handeln. Bei 48 Stunden nach der Injektion, Sieb Zebra Fisch Larven für fluoreszierende Tumorzellentransplantation und Gesundheit.
Entfernen Sie tote oder missgebildete Zebrafische und wählen Sie Zebrafische mit ähnlicher Verzierung aus. Entfernen Sie nicht transplantierte Zebrafische. Entfernen Sie bei injizierten Fischen Dotterfische, bei denen die Grenzen des Jochs nicht um die transplantierte Zellmasse herum zu sehen sind.
Für perikardinjizierte Fische, entfernen Sie Fische, wo injizierte Zellmasse in den Eigelbsack eindringt. Um den ausgewählten Fisch auf eine 96-Well-Platte zu übertragen, schneiden Sie zunächst die Spitze von einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab, gerade groß genug für einen viertägigen Zebrafisch nach der Düngung. 150 Mikroliter E3-Medien mit einem Zebrafisch von der Platte mit der P200 Pipette aspirieren und in einen leeren Brunnen einer flachen 96-Well-Platte geben.
Fügen Sie 150 Mikroliter 2X verdünnte Arzneimittellösung zu jedem Brunnen enthaltenden Zebrafischlarven hinzu, um ein Endvolumen von 300 Mikrolitern mit 1X Medikamentenlösung pro Brunnen zu erreichen. Inkubieren Sie die Platte bei 34 Grad Celsius. Überprüfen Sie täglich nach toten Zebrafischen.
Nach zwei Tagen, wenn gewünscht, aktualisieren Sie das Medikament, indem Sie 200 Mikroliter Flüssigkeit aus jedem Brunnen durch 1X Arzneimittellösung oder DMSO in E3-Medien ersetzen. Entfernen Sie in der Zen-Blau-Software alle unerwünschten Fluoreszenzkanäle in der Bildverarbeitungssoftware und fügen Sie den Dii-Kanal hinzu. Überprüfen Sie den gewünschten Fluoreszenzkanal.
Wählen Sie im selben Fenster aus, wie die Bilder aufgenommen werden sollen, Z-Stacks, Automatisierung, Loops und Serien usw. Stellen Sie sich die DMSO Kontrollfische vor dem medikamentösen behandelten Fisch vor. Und stellen Sie die entsprechende Belichtungszeit in der Bildverarbeitungssoftware ein.
Um die Fluoreszenz zu quantifizieren, öffnen Sie imagej-Software. Wechseln Sie zur Datei, öffnen Sie die gewünschte CZI-Datei, und wählen Sie sie aus. Die Software öffnet ein Importoptionen-Fenster.
Wählen Sie für die Stapelanzeige Hyperstacks aus, überprüfen Sie die öffnenden Dateien einzeln, überprüfen Sie die automatische Skalierung und überprüfen Sie geteilte Kanäle. Wählen Sie für die Farboption colorized aus. Dann klicken Sie auf Plugins, Makros, aufzeichnen.
Klicken Sie auf Bild, anpassen, Schwellenwert. Wählen Sie den Bildtyp rot im Dropdown-Menü auf der rechten Seite des Schwellenfensters aus. Passen Sie den Mindestschwellenwert an, bis die Software nur Bereiche mit Fluoreszenz hervorhebt, und klicken Sie dann auf Anwenden.
Die Software konvertiert das Foto in Schwarzweiß mit dem ausgewählten Bereich in schwarz. Klicken Sie auf Analysieren und Messen. Die Software zieht ein Ergebnisfenster hoch, das den fluoreszierenden Bereich für dieses Bild enthält.
Klicken Sie im Makrorecorder-Fenster auf Erstellen. Dadurch wird ein neues Fenster mit dem Code für das Makro geöffnet. Markieren Sie alle gewünschten Bilder für die Analyse und öffnen Sie sie entsprechend der Stapelanzeige oder Der Farboption.
Wählen Sie Ausführen im Fenster mit dem Makro aus. Das Ergebnisfenster enthält nun den Bereich für jedes Bild. In diesem Protokoll wurden nach 48 Stunden nach der Injektion xenografierte Fische auf fluoreszierend markierte Tumorzellen untersucht und mit Chemotherapie oder DMSO behandelt.
Insgesamt zeigten xenografierte Fische, die mit Vincristin behandelt wurden, die größte und beständigste Abnahme der xenografierten Zellmasse im Vergleich zu DMSO-behandelten Fischen. Dexamethason behandelte Fische zeigten etwa die Hälfte der Reduktion der Tumorfläche im Vergleich zu Vincristin. Aber zeigte immer noch eine Verringerung der Tumorfläche im Vergleich zu DMSO.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um jede Krebszelllinie oder Patientenprobe auf Reaktion auf verschiedene Medikamente oder spezifische gezielte Therapien zu untersuchen, die Einblick in den Tumor jedes Patienten geben.
