Nosso fluxo de trabalho de triagem de medicamentos xenoenxerto de zebrafish permite imagens automatizadas e quantificação de células cancerígenas humanas e sua resposta ao tratamento medicamentoso. Pode ser usado para testar rapidamente a resposta das células cancerígenas de uma paciência a drogas conhecidas ou para identificar novos compostos anticancerígenos. O uso de modelos de xenógrafo de zebrafish e a triagem de medicamentos permite números replicantes inviva que antes só eram obtidos com sistemas in vitro.
Também é muito mais econômico do que os modelos de mouse na triagem através de grandes bibliotecas de compostos. Este fluxo de trabalho tem vários passos desde a interjeição de células cancerígenas em zebrafish até imagens de resposta a medicamentos que são melhor aprendidas pela demonstração visual. Para começar, centrifugar um mínimo de duas vezes 10 a sexta células em cinco milímetros de PBS a 200 vezes g por cinco minutos, e aspirar o supernasce.
Resuspenque a paleta de células em cinco milímetros de solução de coloração dii. Incubar as células a 37 graus Celsius protegidas da luz por 20 minutos. Em seguida, o vórtice suavemente e incubar as células no gelo por 15 minutos protegidos da luz.
Em seguida, centrifugar as células a 200 vezes g por cinco minutos e aspirar o supernante. Lave as células adicionando cinco mililitros de PBS, centrifugando a 200 vezes g por cinco minutos, e aspirando o supernascedor. Repita a lavagem mais uma vez.
Resuspengue as células em um microliter de PBS por 250 mil células vivas e transfira-as para um tubo de microcrédito de 1,5 milímetros. Mantenha as células resuspended no gelo no escuro. Antes de colorar células e injetar, faça placas de ágarose para injetar, derramando 25 mililitros de 3% de agarose em 1X TBE em uma placa de petri e permita que ela se solidifique.
Armazene as placas a 4 graus Celsius por até duas semanas. Também antes de colorir células e injetar, descrilorizar dois dias pós-fertilização zebra peixe usando fórceps sob um microscópio dissecando. Retire das extremidades opostas do acorde protetor do peixe zebra com fórceps até que o chorão chore e o peixe zebra se torne desenvolvido.
Para evitar a aglomeração de células durante a microinjeção, pré frio não filamentoso borossilicar agulhas de vidro a quatro graus Celsius ou no gelo. Imediatamente após as células de coloração, use uma ponta de pipeta de microcarregador para carregar cinco microliters de células manchadas na agulha gelada. Coloque a agulha no braço do microinjetor.
Nivele a ponta da agulha usando uma lâmina de barbear estéril. Usando um micrômetro de estágio, meça o tamanho da gota em óleo mineral. Mantenha o volume de gotículas consistentemente em dois nanoliters, que tem cerca de 1,5 milímetros de diâmetro.
Um minuto após a anestesia, transfira as larvas anestesiadas para uma placa de injeção de superfície plana preparada com 3% de agarose, e injete as larvas com uma bomba de células manchadas no local de injeção desejado. Todas as injeções devem ser concluídas dentro de uma a três horas após a coloração das células para evitar a aglomeração da agulha. Lave as larvas da placa de injeção em uma placa de petri de 10 centímetros contendo mídia E3 sem azul de metileno e incubar a 28 graus Celsius por um período de recuperação de uma hora.
Mova o prato das larvas injetadas para uma incubadora de 34 graus Celsius. Com uma placa de petri vazia colocada entre a prateleira e a placa de petri de larvas para agir como um tampão. Às 48 horas após a injeção, tela zebra larvas de peixe para enenxerção de células tumorais fluorescentes e saúde.
Remova qualquer peixe-zebra morto ou malformado e selecione peixe-zebra com engrafido semelhante. Remova peixes zebra não grafados. Para peixes injetados com gema, remova peixes onde as bordas do jugo não podem ser vistas ao redor da massa celular engrafada.
Para peixe injetado por pericárdio, remova os peixes onde a massa celular injetada invade o saco de gema. Para transferir o peixe selecionado para um prato de 96 poços, primeiro corte a ponta de uma ponta de pipeta de 200 microliter, apenas grande o suficiente para um peixe zebra pós-fertilização de quatro dias para caber. Aspire 150 microliters de mídia E3 com um peixe zebra da placa usando a pipeta P200 e adicione-a a um poço vazio de uma placa de fundo plano de 96 poços.
Adicione 150 microliters de solução de droga diluída 2X a cada poço contendo larvas de peixe zebra para atingir um volume final de 300 microliters com solução de drogas 1X por poço. Incubar a placa a 34 graus Celsius. Procure por peixes de zebra mortos diariamente.
Após dois dias, se desejar, atualize a droga substituindo 200 microliters de líquido de cada poço por solução de medicamentos 1X ou DMSO em mídia E3. No software azul Zen, remova todos os canais fluorescentes indesejados no software de imagem e adicione o canal Dii. Verifique o canal fluorescente desejado.
Na mesma janela, selecione como as imagens serão tiradas, pilhas Z, automação, loops e séries, etc. Imagem o DMSO controlar peixes antes do peixe tratado com drogas. E definir o tempo de exposição apropriado no software de imagem.
Para quantificar a fluorescência, abra o software imagej. Vá para arquivar, abrir e selecionar o arquivo CZI desejado. O software traz uma janela de opções de importação.
Para visualizar pilhas, selecione hiperssilhas, verifique arquivos abertos individualmente, verifique a escala automática e verifique canais divididos. Para a opção de cor, selecione colorado. Em seguida, clique em plugins, macros, grave.
Clique em imagem, ajuste, limiar. Selecione o tipo de imagem como vermelho no menu suspenso no lado direito da janela limiar. Ajuste o limiar mínimo até que o software esteja apenas destacando áreas com fluorescência e, em seguida, clique em aplicar.
O software converte a foto em preto e branco com a área selecionada em preto. Clique em analisar e medir. O software puxa uma janela de resultados contendo a área fluorescente para essa imagem.
Clique em criar na janela do gravador de macro. Isso abre uma nova janela com o código para a macro. Destaque todas as imagens desejadas para análise e abra de acordo com a visualização de empilhamento ou opção de cor.
Selecione executar na janela com a macro. A janela de resultados agora contém a área para cada imagem. Neste protocolo, a 48 horas após a injeção, os peixes xenoenxerados foram examinados para células tumorais fluorescentes e tratados com quimioterapia ou DMSO.
No geral, os peixes xenoengrafados tratados com Vincristine apresentaram a maior e mais consistente diminuição da massa celular xenoenxerada em comparação com os peixes tratados com DMSO. Os peixes tratados com dexametasona apresentaram cerca de metade da redução na área tumoral em comparação com a Vincristina. Mas ainda mostrou uma redução na área do tumor em relação ao DMSO.
Este procedimento pode ser usado para rastrear qualquer linha celular cancerígena ou amostra de paciente para resposta a diferentes drogas ou terapias específicas direcionadas dando uma visão do tumor de cada paciente.
