Наш рабочий процесс скрининга ксенотрансплантата зебры позволяет автоматизированную визуализацию и количественную оценку раковых клеток человека и их реакции на лечение наркоманией. Он может быть использован для быстрого тестирования реакции раковых клеток терпения на известные препараты или для выявления новых противораковых соединений. Использование моделей ксенографа зебры и скрининга лекарств позволяет номера репликантов Inviva, которые ранее были доступны только с системами in vitro.
Кроме того, гораздо более экономически эффективным, чем мыши модели при скрининге через большие библиотеки соединений. Этот рабочий процесс имеет несколько шагов от междометия раковых клеток у зебры до визуализации реакции на наркотики, которые лучше всего изучены с помощью визуальной демонстрации. Для начала, центрифуга как минимум два раза от 10 до шестой клетки в пяти миллиметрах PBS в 200 раз г в течение пяти минут, и аспирировать супернатант.
Resuspend клеточной палитры в пять миллиметров дии окрашивания раствора. Инкубация клеток при 37 градусах Цельсия защищена от света в течение 20 минут. Затем вихрь осторожно и инкубировать клетки на льду в течение 15 минут защищены от света.
Затем центрифуга клетки в 200 раз г в течение пяти минут и аспирировать супернатант. Вымойте клетки, добавив пять миллилитров PBS, центрифугирование в 200 раз г в течение пяти минут, и аспирации супернатанта. Повторите мыть еще раз.
Перепробовать клетки в одном микролитере PBS на 250 тысяч живых клеток и перенести их в 1,5-миллиметровую микро центрифугу. Храните повторно натякое клетки на льду в темноте. Перед окрашивание клеток и инъекций, сделать агарозные пластины для инъекций путем заливки 25 millileiers трех процентов агарозы в 1X TBE в чашку Петри и дайте ему затвердеть.
Храните пластины при четырех градусах Цельсия в течение двух недель. Кроме того, до окрашивания клеток и инъекций, dechlorinate два дня после оплодотворения зебры рыбы с помощью миппов под рассечением микроскопа. Вытяните с противоположных концов защитный хорион зебры рыбы с типсами, пока хорион слезы и зебра рыбы становится unenveloped.
Для предотвращения слипания клеток во время микроинъекции, предварительно охладить не нити борозиликат стеклянные иглы при четырех градусах по Цельсию или на льду. Сразу же после окрашивания клеток, используйте микрозагрузчик пипетки отзыв для загрузки пяти микролитров окрашенных клеток в охлажденной иглы. Загрузите иглу в руку микроинъектора.
Уровень кончик иглы с помощью стерильного лезвия бритвы. Используя микрометр стадии, измерьте размер капли в минеральном масле. Держите объем капли последовательно на двух нанолитров, что составляет около 1,5 миллиметра в диаметре.
Через минуту после анестезии перенесите анестезированную личинку в подготовленную плоскую поверхностную инъекционную пластину с трехпроцентной агарозой и ввезу личинки одним насосом окрашенных клеток в нужном месте инъекции. Все инъекции должны быть завершены в течение одного-трех часов после окрашивания клеток, чтобы предотвратить слипание иглы. Вымойте личинки с инъекционной пластины в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую E3-средства массовой информации без метиленового синего цвета и инкубировать при 28 градусах по Цельсию в течение одного часа периода восстановления.
Перемести блюдо инъекционных личинок в инкубатор по Цельсию на 34 градуса Цельсия. С пустой чашкой Петри, помещенной между полкой и чашкой Петри личинок, чтобы выступать в качестве буфера. На 48 часов после инъекции, экран личинок рыб зебры для флуоресцентных опухолевых клеток engraftment и здоровья.
Удалите мертвых или пороков зебры рыбы, и выбрать зебра рыбы с аналогичным engraftment. Удалите неумененную рыбу-зебру. Для желтка вводили рыбу, удалить рыбу, где границы ига не видно вокруг engrafted клеточной массы.
Для перикард вводили рыбу, удалить рыбу, где вводили клеточной массы посягает в желток мешок. Для передачи выбранной рыбы на 96-хорошо пластины, сначала отрезать кончик 200 микролитер пипетки отзыв, просто достаточно большой для четырехдневного после оплодотворения зебры рыбы, чтобы соответствовать до конца. Аспирировать 150 микролитров E3 средств массовой информации с одной зебры рыбы из пластины с помощью P200 пипетки и добавить его в пустой колодец плоского дна 96-хорошо пластины.
Добавьте 150 микролитров раствора 2X разбавленного препарата к каждому хорошо содержащем личинки рыб зебры, чтобы достичь конечного объема в 300 микролитров с 1X раствором препарата на колодец. Инкубировать пластину при 34 градусах по Цельсию. Проверьте на мертвых рыб зебры ежедневно.
Через два дня, при желании, освежите препарат, заменив 200 микролитров жидкости из каждой колодец раствором препарата 1X или DMSO в средствах массовой информации E3. В программном обеспечении Дзен синий, удалить все нежелательные флуоресцентные каналы в программном обеспечении изображения и добавить канал Dii. Проверьте желаемый флуоресцентный канал.
В том же окне выберите, как будут сделаны изображения, стеки, автоматизация, циклы и серии и так далее. Изображение DMSO контроля рыбы до наркотиков лечение рыбы. И установите соответствующее время экспозиции в программном обеспечении для визуализации.
Для количественной оценки флуоресценции, открытое программное обеспечение imagej. Перейти к файлу, открыть, и выбрать желаемый файл C-ЗИ. Программное обеспечение поднимает окно вариантов импорта.
Для просмотра стеков выберите гиперстаки, проверьте открытые файлы по отдельности, проверьте масштаб автоматической шкалы и проверьте разделенные каналы. Для цветовой опции выберите цветные. Затем нажмите плагины, макросы, запись.
Нажмите на изображение, отрегулируйте, порог. Выберите тип изображения как красный в меню падения вниз с правой стороны порогового окна. Отрегулируйте минимальный порог до тех пор, пока программное обеспечение не выделит только области с флуоресценцией, а затем нажмите кнопку применить.
Программное обеспечение преобразует фотографию в черно-белую с выбранной областью в черном цвете. Нажмите проанализировать и измерить. Программное обеспечение подтягивает окно результатов, содержащее флуоресцентную область для этого изображения.
Нажмите создать на окне макромагнитофона. Это открывает новое окно с кодом для макроса. Выделите все нужные изображения для анализа и откройте в соответствии с укладкой просмотра или цветовой опции.
Выберите запуск на окне с макросом. Окно результатов теперь содержит область для каждого изображения. В этом протоколе, на 48 часов после инъекции, ксенотрансплантированные рыбы были проверены на флуоресцентно помечены опухолевые клетки и лечение химиотерапией или DMSO.
В целом, ксенотрансплантированная рыба, обработанная винкристином, показала самое большое и последовательное снижение ксенотрансплантированных клеточных масс по сравнению с обработанными DMSO рыбами. Дексаметазон лечение рыбы показали около половины сокращения области опухоли по сравнению с Винкристин. Но все же показали снижение площади опухоли по сравнению с DMSO.
Эта процедура может быть использована для проверки любой линии раковых клеток или образца пациента для ответа на различные препараты или конкретные целевые терапии дает представление о опухоли каждого пациента.
