Nuestro flujo de trabajo de detección de fármacos de xenoinjerto de peces cebra permite obtener imágenes automatizadas y cuantificar las células cancerosas humanas y su respuesta al tratamiento farmacológico. Se puede utilizar para probar rápidamente la respuesta de las células cancerosas de una paciencia a fármacos conocidos o para identificar nuevos compuestos contra el cáncer. El uso de modelos de xenografo de peces cebra y cribado de fármacos permite números replicantes de Inviva que anteriormente solo se obtenían con sistemas in vitro.
También es mucho más rentable que los modelos de ratón en la detección a través de grandes bibliotecas de compuestos. Este flujo de trabajo tiene varios pasos desde la interjección de células cancerosas en el pez cebra hasta la toma de imágenes de la respuesta de los fármacos que se aprenden mejor mediante la demostración visual. Para empezar, centrifugar un mínimo de dos veces 10 a las sextas células en cinco milímetros de PBS a 200 veces g durante cinco minutos, y aspirar el sobrenadante.
Resuspender la paleta de celdas en cinco milímetros de solución de tinción dii. Incubar las células a 37 grados centígrados protegidos de la luz durante 20 minutos. Luego vórtice suavemente e incubar las células sobre hielo durante 15 minutos protegidos de la luz.
Luego centrifugar las células a 200 veces g durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante. Lavar las células añadiendo cinco mililitros de PBS, centrifugando a 200 veces g durante cinco minutos, y aspirando el sobrenadante. Repita el lavado una vez más.
Resuspender las células en un microlitro de PBS por cada 250 mil células vivas y transferirlas a un tubo de micro centrífuga de 1,5 milímetros. Mantenga las células resuspendidas sobre hielo en la oscuridad. Antes de manchar las células y la inyección, hacer placas de agarosa para inyectar mediante verter 25 milivas de tres por ciento de agarosa en 1X TBE en un plato de petri y permitir que se solidifique.
Guarde las placas a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos semanas. También antes de tinr las células y la inyección, desclororar dos días después de la fertilización de peces cebra utilizando fórceps bajo un microscopio diseccionador. Tire de los extremos opuestos de la tarea protectora del pez cebra con fórceps hasta que la chorion se desgarra y el pez cebra se desenroje.
Para evitar la aglutinación de células durante la microinyección, precaldar agujas de vidrio borosilicato no filamentoso a cuatro grados celsius o sobre hielo. Inmediatamente después de manchar las células, utilice una punta de pipeta de microcargador para cargar cinco microlitros de células manchadas en la aguja refrigerada. Cargue la aguja en el brazo microinyector.
Nivele la punta de la aguja con una cuchilla de afeitar estéril. Con un micrómetro de etapa, mida el tamaño de las gotas en aceite mineral. Mantenga el volumen de gotas consistentemente en dos nanolitros, que es de alrededor de 1,5 milímetros de diámetro.
Un minuto después de la anestesia, transfiera las larvas anestesiadas a una placa de inyección de superficie plana preparada con tres por ciento de agarosa, e inyecte las larvas con una bomba de células manchadas en el lugar de inyección deseado. Todas las inyecciones deben completarse dentro de una a tres horas después de manchar las células para evitar la aglomeración de la aguja. Lavar las larvas de la placa de inyección en un plato de petri de 10 centímetros que contenga medios E3 sin azul de metileno e incubar a 28 grados centígrados durante un período de recuperación de una hora.
Mueva el plato de las larvas inyectadas en una incubadora de 34 grados Celsius. Con un plato de petri vacío colocado entre el estante y el plato petri de larvas para actuar como un tampón. A las 48 horas después de la inyección, criba larvas de peces cebra para detectar el injerto y la salud de las células tumorales fluorescentes.
Retire cualquier pez cebra muerto o malformado, y seleccione peces cebra con un injerto similar. Retire los peces cebra no injertados. Para los peces inyectados con yema, retire los peces donde los bordes del yugo no se pueden ver alrededor de la masa celular injertada.
Para los peces inyectados con pericardio, retire los peces donde la masa celular inyectada invada el saco de yema. Para transferir el pescado seleccionado a un plato de 96 pozos, primero corte la punta de una punta de pipeta de 200 microlitros, lo suficientemente grande como para que un pez cebra de fertilización de cuatro días para caber a través. Aspirar 150 microlitros de medios E3 con un pez cebra de la placa utilizando la pipeta P200 y añadirlo a un pozo vacío de una placa plana inferior de 96 pisos.
Añadir 150 microlitros de solución de fármacos diluidos 2X a cada pozo que contenga larvas de peces cebra para alcanzar un volumen final de 300 microlitros con solución de fármaco 1X por pozo. Incubar la placa a 34 grados centígrados. Compruebe si hay peces cebra muertos todos los días.
Después de dos días, si se desea, refrescar el medicamento mediante la sustitución de 200 microlitros de líquido de cada pozo con solución de fármaco 1X o DMSO en medios E3. En el software Zen blue, elimine todos los canales fluorescentes no deseados en el software de imágenes y añada el canal Dii. Compruebe el canal fluorescente deseado.
En la misma ventana, seleccione cómo se tomarán las imágenes, pilas Z, automatización, bucles y series, etc. Imagen del pez de control DMSO antes de los peces tratados con drogas. Y establezca el tiempo de exposición adecuado en el software de imágenes.
Para cuantificar la fluorescencia, abra el software imagej. Vaya a archivo, abra y seleccione el archivo CZI deseado. El software abre una ventana de opciones de importación.
Para la visualización de la pila, seleccione las hiperapilas, compruebe los archivos abiertos individualmente, compruebe la escala automática y compruebe los canales divididos. Para la opción de color, seleccione colorizado. A continuación, haga clic en plugins, macros, grabar.
Haga clic en imagen, ajuste, umbral. Seleccione el tipo de imagen como rojo en el menú desplegable en el lado derecho de la ventana de umbral. Ajuste el umbral mínimo hasta que el software solo resalte las áreas con fluorescencia y, a continuación, haga clic en Aplicar.
El software convierte la foto a blanco y negro con el área seleccionada en negro. Haga clic en analizar y medir. El software extrae una ventana de resultados que contiene el área fluorescente de esa imagen.
Haga clic en Crear en la ventana de grabadora de macros. Esto abre una nueva ventana con el código de la macro. Resalte todas las imágenes deseadas para el análisis y ábralas según la visualización de apilamiento o la opción de color.
Seleccione Ejecutar en la ventana con la macro. La ventana de resultados ahora contiene el área de cada imagen. En este protocolo, a las 48 horas después de la inyección, los peces xenoinjertados fueron examinados para detectar células tumorales con etiqueta fluorescente y tratados con quimioterapia o DMSO.
En general, los peces xenoinjertados tratados con Vincristina mostraron la mayor y más consistente disminución de la masa celular xenoinjertada en comparación con los peces tratados con DMSO. Los peces tratados con dexametasona mostraron aproximadamente la mitad de la reducción en el área tumoral en comparación con la Vincristina. Pero todavía mostró una reducción en el área tumoral en comparación con DMSO.
Este procedimiento se puede utilizar para examinar cualquier línea celular de cáncer o muestra de paciente para la respuesta a diferentes medicamentos o terapias específicas dirigidas que dan una idea del tumor de cada paciente.
