لدينا حمار وحشي xenograft المخدرات فحص سير العمل يسمح للتصوير الآلي وتكميم خلايا السرطان البشرية واستجابتها للعلاج من المخدرات. ويمكن استخدامه لاختبار سريع استجابة الخلايا السرطانية الصبر للأدوية المعروفة أو لتحديد مركبات جديدة لمكافحة السرطان. استخدام نماذج الحمار الوحشي xenograph وفحص المخدرات يسمح ل Inviva الأرقام المقلدة التي كانت في السابق فقط الحصول عليها مع النظم في المختبر.
كما أنها أكثر فعالية من حيث التكلفة من نماذج الماوس في الفحص من خلال مكتبات كبيرة من المركبات. هذا العمل لديه عدة خطوات من تدخل الخلايا السرطانية في حمار وحشي لتصوير استجابة المخدرات التي يتم تعلمها بشكل أفضل عن طريق مظاهرة بصرية. للبدء، الطرد المركزي على الأقل مرتين 10 إلى الخلايا السادسة في خمسة ملليمترات من برنامج تلفزيوني في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، ويتبخر.
Resuspend لوحة الخلية في خمسة ملليمترات من حل دي تلطيخ. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 20 دقيقة. ثم دوامة بلطف واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء.
ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق ويتبخر ونافر. غسل الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، وpirating ناضح. كرر غسل مرة واحدة إضافية.
إعادة تعليق الخلايا في ميكرولتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل 250 ألف خلية حية ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليمتر. إبقاء الخلايا التي أعيد تعليقها على الجليد في الظلام. قبل تلطيخ الخلايا وحقن، وجعل لوحات agarose لحقن عن طريق صب 25 ملليلتر من ثلاثة في المئة agarose في 1X TBE في طبق بتري والسماح لها لترسيخ.
تخزين لوحات في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. أيضا قبل تلطيخ الخلايا وحقن، إزالة الكلور يومين بعد الإخصاب الأسماك الحمار الوحشي باستخدام ملقط تحت مجهر تشريح. سحب من طرفي نقيض من المشيمة واقية من الأسماك حمار وحشي مع ملقط حتى الدموع المشيمية والأسماك حمار وحشي يصبح غير مظلل.
لمنع تكتل الخلايا أثناء الحقن المجهري، قبل البرد غير خيوط البوروسيليكات الإبر الزجاجية في أربع درجات مئوية أو على الجليد. مباشرة بعد تلطيخ الخلايا، استخدم طرف ماصة microloader لتحميل خمسة ميكرولترات من الخلايا الملطخة في الإبرة المبردة. قم بتحميل الإبرة في ذراع الحقن الدقيق.
مستوى طرف إبرة باستخدام شفرة حلاقة معقمة. باستخدام ميكرومتر المرحلة، وقياس حجم قطرة في الزيوت المعدنية. الحفاظ على حجم قطرات باستمرار في اثنين من nanoliters، والتي هي حوالي 1.5 ملليمتر في القطر.
بعد دقيقة واحدة من التخدير ، قم بنقل اليرقات المخدرة إلى لوحة حقن سطحية مستوًا معدة مع ثلاثة في المئة من الأغاروز ، وحقن اليرقات بمضخة واحدة من الخلايا الملطخة في موقع الحقن المطلوب. يجب أن تكتمل جميع الحقن في غضون ساعة إلى ثلاث ساعات بعد تلطيخ الخلايا لمنع تكتل الإبرة. اغسل اليرقات من صفيحة الحقن في طبق بتري طوله 10 سنتيمترات يحتوي على E3 وسائط بدون أزرق الميثيلين واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للتعافي.
نقل طبق اليرقات المحقونة إلى حاضنة درجة مئوية 34. مع طبق بتري فارغ يوضع بين الرف وطبق بتري من اليرقات ليكون بمثابة عازل. في 48 ساعة بعد الحقن، وشاشة يرقات الأسماك حمار وحشي لgraftment الخلايا السرطانية الفلورية والصحة.
إزالة أي أسماك حمار وحشي الميت أو المشوه، وتحديد الأسماك حمار وحشي مع engraftment مماثلة. إزالة الأسماك حمار وحشي غير مغر. بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها بالرفار، قم بإزالة الأسماك حيث لا يمكن رؤية حدود النير حول كتلة الخلايا المحنّة.
بالنسبة للأسماك التي يتم حقنها بالبيراصير، قم بإزالة الأسماك حيث تتعدى كتلة الخلايا المحقونة في كيس صفار. لنقل الأسماك المختارة إلى لوحة 96 جيدا، وقطع أولا طرف قبالة 200 ميكرولتر ماصات تلميح، فقط كبيرة بما يكفي لمدة أربعة أيام بعد الإخصاب الأسماك الحمار الوحشي لتناسب من خلال. pirate 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام E3 مع سمكة حمار وحشي واحدة من لوحة باستخدام ماصة P200 وإضافتها إلى بئر فارغة من لوحة مسطحة أسفل 96 جيدا.
إضافة 150 ميكرولترات من 2X محلول المخدرات المخفف إلى كل بئر تحتوي على يرقات الأسماك حمار وحشي للوصول إلى حجم النهائي من 300 ميكرولترات مع 1X حل المخدرات في بئر. احتضان لوحة في 34 درجة مئوية. تحقق من وجود أسماك حمار وحشي ميتة يوميا.
بعد يومين، إذا رغبت في ذلك، تحديث الدواء عن طريق استبدال 200 ميكرولترات من السائل من كل بئر مع 1X حل المخدرات أو DMSO في وسائل الإعلام E3. في برنامج Zen Blue، قم بإزالة جميع القنوات الفلورية غير المرغوب فيها في برنامج التصوير وأضف قناة Dii. تحقق من قناة الفلورسنت المطلوبة.
في نفس النافذة، حدد كيفية التقاط الصور، واصمّة Z، والأتمتة، والحلقات، والسلسلة، وما إلى ذلك. صورة لـ DMSO تتحكم في الأسماك قبل أن يتم علاج المخدرات. وتعيين وقت التعرض المناسب في برنامج التصوير.
لتحديد كمية الفلوريسنس، فتح برنامج imagej. انتقل إلى ملف، وفتح، وحدد ملف CZI المطلوب. البرنامج إحضار نافذة خيارات الاستيراد.
لعرض المكدس، حدد الـ hyperstacks، تحقق من فتح الملفات بشكل فردي، تحقق من المقياس التلقائي، وتحقق من القنوات المنقسمة. بالنسبة إلى خيار اللون، حدد ملون. ثم انقر فوق الإضافات ، وحدات الماكرو ، سجل.
انقر فوق الصورة، وضبط، والحد. حدد نوع الصورة باللون الأحمر في القائمة المنسدلة على الجانب الأيمن من نافذة العتبة. اضبط الحد الأدنى حتى يقوم البرنامج فقط بتمييز المناطق ذات الفلور، ثم انقر فوق تطبيق.
البرنامج يحول الصورة إلى أبيض وأسود مع المنطقة المحددة باللون الأسود. انقر فوق تحليل وقياس. البرنامج تسحب ما يصل نافذة النتائج التي تحتوي على منطقة الفلورسنت لتلك الصورة.
انقر فوق إنشاء على نافذة مسجل الماكرو. هذا يفتح إطار جديد مع التعليمات البرمجية الماكرو. تسليط الضوء على جميع الصور المطلوبة للتحليل وفتح وفقا ل التراص عرض أو لون الخيار.
حدد تشغيل على الإطار مع الماكرو. إطار النتائج الآن يحتوي على منطقة لكل صورة. في هذا البروتوكول، في حقن بعد 48 ساعة، تم فحص الأسماك xenografted للخلايا السرطانية المسمى الفلورسنت وعلاجها مع العلاج الكيميائي أو DMSO.
وعموما، أظهرت الأسماك ذات الشطة التي عولجت بفينكريستين أكبر انخفاض وأكثر اتساقا في كتلة الخلايا xenografted مقارنة بالأسماك المعالجة من قبل نظام إدارة الوجهات السياحية. وأظهرت الأسماك المعالجة Dexamethasone حوالي نصف الانخفاض في منطقة الورم مقارنة مع Vincristine. ولكن لا يزال أظهر انخفاضا في منطقة الورم مقارنة مع DMSO.
يمكن استخدام هذا الإجراء لفحص أي خط خلية سرطانية أو عينة المريض للاستجابة لأدوية مختلفة أو علاجات محددة مستهدفة تعطي نظرة ثاقبة على ورم كل مريض.
