Mit diesem Protokoll können Zellmigration und Invasion unter Echtzeitbedingungen enthüllt werden, so dass die Zellkinetik unter Verlust oder Gewinn der Genfunktion und der Medikamente bestimmt werden kann. Im Gegensatz zu anderen Methoden sind keine Färbungen, mechanische Zellschäden oder fluoreszierende Marker erforderlich. Am wichtigsten ist, dass die Echtzeit-Zellkinetik effektiv bestimmt werden kann.
Wenn die U-118MG-Zelllinienkultur 70 bis 80 % Konfluenz erreicht, waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie die Zellen mit zwei Millilitern 0,5% Trypsin-EDTA behandeln. Nach 30 Sekunden bei 37 Grad Celsius, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter frisches Kulturmedium und übertragen Sie die abgetrennten Zellen in ein 15 Milliliter konisches Rohr. Nach dem Zählen die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in sechsmal 10 bis fünf Zellen pro Konditionskonzentration im entsprechenden Volumen des frischen Mediums wieder aufsetzen.
Übertragen Sie sechsmal 10 in die fünfte Zelle in ein Mikrozentrifugenrohr pro Zustand und fügen Sie 800 Mikroliter Dulbeccos PBS zu jedem Rohr hinzu. Nach der Zentrifugation jedes Pellet in 60 MikroliterResuspensionspuffer R und sechs Mikromolaren der siRNA von Interesse wieder aufsetzen. Mischen Sie jedes Rohr mit sanftem Klopfen, bevor Sie 10 Mikroliter Aliquots jeder Zellsuspension mit drei 10-Millisekunden-Pulsen von 350 Volt elektropoieren.
Nach jeder Behandlung die elektropoierten Zellen aus jedem Zustand in einzelnen fünf Milliliter-Aliquots des frischen Kulturmediums bündeln. Dann säen Sie die Zellen in zwei 35-Millimeter-Kulturgerichte pro Zustand und legen Sie die Zellen für drei Tage in den Zellkultur-Inkubator. Legen Sie das Echtzeit-Zellanalysesystem fünf bis sechs Stunden vor der Echtzeit-Zellanalyse in den Zellkultur-Inkubator.
Um einen Invasionstest einzurichten, verwenden Sie Reverse Pipetting, um 50 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 0,1 Mikrogramm pro Milliliter extrazellulärem Matrixgel, in jeden Brunnen der oberen Kammer einer Zellinvasionsplatte zu platzieren. Unmittelbar nach der Beschichtung 30 Mikroliter der extrazellulären Matrixlösung aus jedem Brunnen entfernen und vier Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator legen. Um ein Impedanzmessprogramm einzurichten, ersetzen Sie sechs Stunden vor der Messung das Medium in allen elektroporated Zellkulturen durch ein niedriges Serummedium.
Wählen Sie unter der Registerkarte Layout in der zugehörigen Impedanzmesssoftware Quadruplicate-Bohrungen für jeden biologischen Zustand aus. Legen Sie unter der Registerkarte Zeitplan einen einmaligen Basismess-Sweep-Schritt mit einem Ein-Minuten-Intervall fest, und legen Sie einen zweiten Schritt fest, um die Zellimpedanz in den jeweiligen einzelnen Wiegen für das eigentliche Experiment zu messen. Eine Stunde vor Beginn der Zellimpedanzmessung 160 Mikroliter Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, als Chemoattraktionin in die Brunnen der unteren Kammer der Zellinvasions- und Migrationsplatte geben.
Um die Invasion zu messen, montieren Sie die obere Kammer mit den extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Brunnen. Um die Migration zu messen, verwenden Sie unbeschichtete Brunnen in der oberen Kammer. Für beide Arten von Experimenten, füllen Sie die Brunnen in der oberen Kammer mit 50 Mikroliter low serum Medium und legen Sie die Kammern in die Wiege des Systems.
Klicken Sie auf die Registerkarte Nachricht in der Software, um zu ermitteln, ob alle Bohrungen von der Steuereinheit erkannt werden. Wenn die Meldung wie erwartet angezeigt wird, ist die Platte in der Wiege für das Experiment bereit. Dann legen Sie die komplett verpackten Platten in den Zellkultur-Inkubator im Echtzeit-Zellanalysesystem Wiege für eine Stunde, um die Platte an die Zellkulturbedingungen zu akklimatisieren.
Während die Platten ausgeglichen sind, ernten Sie die Glioblastomzellen wie gezeigt und suspendieren Sie die Zellen aus jedem Zustand mit acht mal 10 bis fünf Zellen pro 800 Mikroliter niedriger Serummittelkonzentration. Zusätzlich legen Sie eine drei mal 10 bis die fünften Zellen in zwei Milliliter Kulturmedium für die Aussaat in einer 35-Millimeter-Schale für die nachgelagerte Western Blot-Analyse beiseite. Um den Basiswert vor der Migration zu messen, klicken Sie am Ende der Akklimatisierung auf die Schaltfläche Start in der Wiege.
Nachdem die Basismessung erworben wurde, übertragen Sie die Migrations- und Invasionsplatten von ihren jeweiligen Wiegen in einen Biosicherheitsschrank. Reverse Pipetten 100 Mikroliter Zellen in quadruplicate oberen Kammerbrunnen für jeden biologischen Zustand in der entsprechenden Bohrung der Zellinvasion und Migrationsplatten, wie in der Steuereinheit der Wiege programmiert. Nach dem Aussaat die Platten im Biosicherheitsschrank 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, damit sich die Zellen gleichmäßig auf dem Plattenboden absetzen können, bevor sie die Platten in ihre jeweiligen Wiegen überführen.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Wiege, um mit der Messung der Zellimpedanz zu beginnen. Um die Änderungen der Zellimpedanz als Zellindex während oder nach Abschluss des Experiments zeitabhängig zu visualisieren, öffnen Sie die Registerkarte Datenanalyse. Um die Daten für jede der jeweiligen Bedingungen einzeln oder als Mittelwerte und/oder Standardabweichungen zu visualisieren, klicken Sie auf die Optionsfelder für Durchschnitts- und Standardabweichungen.
Um die Zellenindexdaten in eine Tabellenkalkulationsdatei zu exportieren, platzieren Sie den Cursor in der Mitte des Datenanalysefensters, und klicken Sie mit der rechten Maustaste. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld die Option Daten in Listenformat kopieren aus, und fügen Sie die Daten in eine geöffnete Kalkulationstabelle ein. Um das Experiment freizugeben, klicken Sie in jeder Wiege auf die Schaltfläche Freigabe.
Crk Adapter Protein Knockdown verringert Crk1 und Crk2 Proteinspiegel um 85% bzw. 86%, ohne Crk-ähnliche Proteinspiegel zu induzieren. Der Knockdown von Crk-like reduziert die Crk-ähnliche Proteinexpression um 85% mit leichten Reduktionen des Crk1- und Crk2-Proteinspiegels. Durch die Kombination beider siRNAs wird der Crk1-, Crk2- und Crk-ähnliche Ausdruck um über 80 % reduziert, während weder Vinculin noch Alpha-Tubulin-Expression durch eine Kombination von Crk- oder Crk-ähnlichem Knockdown beeinflusst wird.
Glioblastomzellen des menschlichen Gehirns wandern entlang eines Gradienten als Reaktion auf hohe Serumkonzentrationen, die das maximale Migrationsniveau von 13 Stunden erreichen. In Crk-Knockdown-Zellen wurde die Migration zwar zunächst verzögert, aber die Zellen wanderten bis zu 23 Stunden weiter. Crk-like knockdown reduziert die Zellmigration erheblich, wobei die Glioblastom-Zelllinie ihre Migrationsfähigkeit vollständig verliert, wenn crk und Crk-like darauf hindeuten, dass Crk und Crk-like wesentliche überlappende Rollen bei der Migration von Krebszellen spielen.
Wenn jedoch die Zellinvasion über mehrere Tage überwacht wird, erreichen die Crk-Knockdown-Zellen ein ähnliches maximales Maß an Zellinvasion im Vergleich zur Kontrolle von Glioblastomzellen nach 60 Stunden, wobei Crk-ähnliche Zellen ihre invasive Fähigkeit teilweise um 90 Stunden wiederherstellen und doppelte Crk-Crk-Zellen eine verminderte Fähigkeit zeigen, nach 40 Stunden einzudringen. Die Ergebnisse stützen eindeutig den Vorschlag, dass die Zellinvasion über den gesamten Zeitraum des Experiments analysiert werden sollte. Die richtige Anzahl von Zellen auszusäen und die Luftblasen zu vermeiden, während die extrazelluläre Matrix für Invasions-Assay und Saatzellen aufgezeichnet wird, sind Schlüsselpunkte für den Erfolg dieses Experiments.
Nach einem ähnlichen Verfahren, aber mit E-Platten, Zellhaftung und Zellproliferation Skinetik kann bestimmt werden.
