0.Unser Protokoll beschreibt eine optimierte und reproduzierbare Methode zur Erzeugung von Osteoklasten in vitro, mit der die Mechanismen untersucht werden können, die ihrem Differenzierungsprozess und ihrer Funktionalität zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, innerhalb von nur einer Woche eine große Anzahl funktionell aktiver Osteoklasten zu erzeugen. Eine hohe Differenzierungsausbeute wird durch die Verwendung von gereinigten Monozyten und die rechtzeitige Zugabe von Zytokinen erreicht.
Osteoklasten sind für die Knochenzerstörung bei allen Formen von Arthritis verantwortlich, und diese Methode bietet die Werkzeuge, um neue therapeutische Verbindungen zu untersuchen, die ihre Differenzierung und/oder Funktionen modulieren können. Patricia Riedlova, Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Isolieren Sie zunächst die PBMCs, indem Sie das Blut in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführen.
Verdünnen Sie es mit sterilem PBS in gleicher Menge für frisches Blut oder im Verhältnis 1:3 für Leukozytenzapfen und Buffy-Mäntel. Mischen Sie das Blut vorsichtig durch Umkehrung. Bereiten Sie 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern Dichtegradientenmedium vor und schichten Sie langsam acht bis 10 Milliliter verdünntes Blut auf das Dichtegradientenmedium, um ein Mischen zu vermeiden.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse. Anschließend die oberste Schicht vorsichtig mit einer Pasteurpipette entsorgen. Sammeln Sie die darunter liegende Interphasenschicht, die die PBMCs enthält, und übertragen Sie diese Schicht in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.
Suspendieren Sie die Zellen bis zu 50 Milliliter mit sterilem PBS und waschen Sie das Restdichtegradientenmedium ab, indem Sie bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Vollbremse zentrifugieren. Um Restplättchen zu entfernen, wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess wie im Manuskript beschrieben, resuspendieren Sie die isolierten und gereinigten PBMCs in 20 Millilitern PBS und zählen Sie sie mit einem Hämazytometer nach der Standardmethode. Um CD14+-Monozyten anzureichern, übertragen Sie 1 x 10 auf die siebten PBMCs in ein geeignetes Polystyrol-Rundbodenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 x g.
Nachdem Sie den Überstand verworfen und das Zellpellet im Zelltrennpuffer resuspendiert haben, inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 10 Mikrolitern Antikörpercocktail pro 100 Mikroliter bei geschlossenem Deckel. Fügen Sie am Ende der Inkubation 10 Mikroliter der magnetischen Nanopartikelkügelchen pro 100 Mikroliter hinzu und inkubieren Sie sie drei Minuten lang mit geschlossenem Deckel. Füllen Sie das Volumen mit dem Zelltrennpuffer auf 2,5 Milliliter auf.
Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und inkubieren Sie es drei Minuten lang bei geschlossenem Deckel. Verwerfen Sie nun die negative Zellpopulation mit einer kontinuierlichen Bewegung durch Umkehrung, während sich die Röhre noch im Magneten befindet. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten, waschen Sie die angereicherten CD14+-Monozyten, die an den magnetischen Kügelchen befestigt sind, indem Sie sie in 2,5 Millilitern des Zellsuspensionspuffers resuspendieren, und setzen Sie das Röhrchen wieder in den Magneten ein.
Zählen Sie die isolierten Zellen wie zuvor gezeigt. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen fünf Minuten lang bei 300 x g. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die Zellen bei 1 Million Zellen pro Milliliter in einem vollständigen Alpha-Minimum Essential Medium mit 10 % FBS resuspendiert.
Um den Osteoklasten zu differenzieren, fügen Sie der Zellsuspension M-CSF in einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie durch gründliches Pipettieren, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Platte 100 Mikroliter der Suspension pro Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter steriles destilliertes Wasser pro Vertiefung um die plattierten Zellen hinzu, um eine Verdunstung des Mediums und Kanteneffekte im Kultursystem zu vermeiden.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht für ca. 18 bis 20 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie frische Medien vor, die mit M-CSF und RANK-Liganden ergänzt werden. Nach der Inkubation wird die Hälfte des Mediums vorsichtig durch Aspiration mit einer P200-Pipette entfernt und durch frisches, warmes Komplettmedium ersetzt, das mit M-CSF und RANK-Liganden in einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter ergänzt wird.
Differenzieren Sie die Zellen sieben bis 14 Tage lang in Osteoklasten, wobei alle drei Tage ein vollständiger Austausch des Mediums erfolgt. Nach dem Entfernen des Mediums fixieren Sie die differenziert adhärenten Osteoklasten mit 100 Mikrolitern der hergestellten Fixierlösung pro Well und inkubieren Sie sie eine Minute lang. Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen, um Kratzer an den adhärenten Zellen zu vermeiden.
Sobald die Vertiefungen dreimal mit 300 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurden, klopfen Sie die Platten trocken und geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Färbelösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius im Dunkeln für 20 Minuten. Entfernen Sie nach der Inkubation die Färbelösung durch Inversion und waschen Sie die Platte dreimal mit 300 Mikrolitern destilliertem Wasser pro Welle.
Entfernen Sie das überschüssige Wasser, indem Sie die Teller auf Papiertücher klopfen, und lassen Sie die Teller offen und lichtgeschützt über Nacht an der Luft trocknen. Nehmen Sie mit einem Hellfeldmikroskop mit Kacheloption Bilder mit 10-facher oder 20-facher Vergrößerung auf, um die gesamte Well-Oberfläche zu erfassen. Zählen Sie die Osteoklasten, die als TRAP+violett gefärbte Zellen mit mehr als drei Kernen identifiziert wurden, manuell mit einer Bildanalysesoftware mit einem Zellzähler-Plugin.
Platte 100-Mikroliter der isolierten CD14+Monozyten-pro-Well-Kammer in einer 18-Well-Kammer mit einer Zelldichte von 1 x 10 bis zur fünften Zelle pro Well. Differenzieren Sie die Osteoklasten in Gegenwart von M-CSF- und RANK-Liganden, wie bereits gezeigt, mit einem vollständigen Wechsel des Mediums alle drei Tage. Entfernen Sie das Medium am Ende vorsichtig und waschen Sie es zweimal mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem PBS bei einem pH-Wert von 7,4.
Lassen Sie die Vertiefungen zwischen den Schritten nicht trocknen. Fixieren Sie die Probe mit 100 Mikrolitern 4%iger Formaldehydlösung pro Vertiefung in PBS und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Well.
Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,1%iger Triton x-100-Lösung, die in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, wie zuvor gezeigt. Zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung waschen. Um die unspezifische Bindung zu blockieren und das Signal zu verstärken, fügen Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung hinzu, die mit 2%igem Rinderserumalbumin und PBS-Lösung hergestellt wurde.
20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln inkubieren. Nachdem Sie die Blockierlösung entfernt haben, geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzkonjugierte Phalloidinlösung, verdünnt in 2%ige BSA/PBS-Lösung, in jede Vertiefung. Zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung waschen.
Die Kerne werden mit 100 Mikrolitern einer PBS-Lösung mit 300 nanomolaren DAPI pro Vertiefung gefärbt. Entfernen Sie nach 10 bis 15 Minuten die DAPI-Lösung und ersetzen Sie sie durch PBS mit 100 Mikrolitern pro Well. Visualisieren Sie die Färbung mit geeigneten Immunfluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopen bei vier bis 40x.
Die reifen Osteoklasten sind definiert als TRAP+multiple nukleäre Zellen. Die Zugabe von RANK-Liganden erzeugte eine zunehmende Anzahl von großen TRAP+mehrkernigen Osteoklasten in dosisabhängiger Weise. Die Kinetik der Differenzierung von Osteoklasten aus Monozyten wurde über einen Kulturzeitraum von zwei bis 14 Tagen untersucht.
Mehrkernige Osteoklasten waren ab dem fünften Tag sichtbar, und am siebten Tag wurde eine optimale Differenzierung erreicht. Die Differenzierung von Osteoklasten auf mineralisierten Oberflächen ermöglicht es, deren Resorptionsaktivität durch die Analyse der Bildung von runden Löchern oder Resorptionsgruben zu beurteilen. Der Prozentsatz der Resorption steigt in Gegenwart von M-CSF und RANK-Liganden im Vergleich zu M-CSF allein signifikant an.
Weiterhin hemmte die Behandlung mit Rotenon dosisabhängig die Resorption der mineralisierten Oberfläche im Vergleich zur unbehandelten Kontrollbohrung. Die Rotenon-abhängige Hemmung der Osteoklastenresorption war mit der Hemmung der ATP-Produktion assoziiert. Die Fragmentierung des vom RANK-Liganden abgeleiteten Aktinrings des reifen OCS wurde in Gegenwart von Rotenon beobachtet.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass die angereicherten Monozyten keine Blutplättchen enthalten, dass die Zellen mit der richtigen Dichte plattiert sind und dass die umgebenden Vertiefungen mit Wasser gefüllt sind, um den Kanteneffekt zu vermeiden. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, um mechanistisch zu untersuchen, wie sich Osteoklasten bilden und was ihre Funktionalität sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Wissenschaft beeinflusst. Zum Beispiel durch den Einsatz von Verbindungen oder Proteinen, die diese Prozesse modulieren können.
