Die Forschung wurde durch den NHLBI Research Scientist Development Grant (1K01HL135461-01) an JAG unterstützt. Vielen Dank an David Carmona-Berrio und Isabel Adarve-Rengifo für ihre technische Unterstützung.

Mäuse wurden im Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Division of Animal Care nach den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des US-Gesundheitsministeriums untergebracht und gepflegt. Alle Tierverfahren wurden vor Beginn der Experimente vom VUMC Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Tierpräparation und Präparation
<ol><li>Schalten Sie den Keimer und die Wasserpumpe des Heizkissens ca. 30 min vor Beginn der Operation ein.</li>
	<li>Schneiden Sie 0,5 mm lange Polyurethanschläuche mit einem scharfen Skalpell. Entfernen Sie 0,2 mm des Umfangs, indem Sie einen Schnitt der Länge nach machen, um eine Manschette zu machen. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Teil der Nierenarterienstenose, der äußerste Präzision, Liebe zum Detail und Geduld erfordert. Versuchen Sie, mehrere Stücke Polyurethanschläuche gleichzeitig zu schneiden. Führen Sie alle diese Verfahren unter dem Mikroskop durch.</li>
	<li>Bevor Sie fortfahren, ziehen Sie chirurgische sterile Handschuhe und eine chirurgische Maske an.</li>
	<li>Verwenden Sie C57BL / 6 Wildtyp-Mäuse (WT) von 6-8 Wochen. Verwenden Sie eine gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Mäusen, um sexuelle Verzerrungen zu vermeiden.</li>
	<li>Notieren Sie das Gewicht der Mäuse, bevor Sie eine Operation durchführen. Das Idealgewicht für die Durchführung einer Nierenarterienstenose mit Polyurethanschlauch beträgt 18-22 g. Behandeln Sie Mäuse vorsichtig und bewegen Sie sich nicht, während Sie die Anästhesie injizieren. Präoperative Analgesie (Ketofgen, 5 mg/kg Körpergewicht) verabreichen. HINWEIS: Wenn Sie die Mäuse von ihrem Wohnzimmer in den Operationssaal bringen, tragen Sie sie mit großer Sanftheit und Vorsicht, um Unruhe zu vermeiden. Es wird dringend empfohlen, Mäusekäfige in den Händen anstelle eines Trolleys zu tragen.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg KG) und Xylazin (10 mg/kg KG) über intraperitoneale (I.P.) Injektionen.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig, bis sie vollständig betäubt ist. Es dauert etwa 4-5 Minuten, bis die Maus völlig bewusstlos ist. Kneifen Sie den Schwanz oder Zeh mit einer Pinzette, um zu überprüfen, ob die Maus völlig bewusstlos und bereit für die Operation ist.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Papiertuch. Entfernen Sie die Haare des seitlichen Bauches mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in entgegengesetzter Richtung des Haarwuchses. Nachdem Sie die Operationsstelle rasiert haben, reinigen Sie den Bereich mit einem chirurgischen Peeling, das Jod (oder Chlorhexidin) enthält, gefolgt von einer Spülung mit 70% Ethanol (oder steriler Kochsalzlösung).  Wiederholen Sie 3 mal. HINWEIS: Die Haarentfernung muss in einiger Entfernung oder vorzugsweise auf einer anderen Bank als die Operationsbank durchgeführt werden, um Haarstörungen und Haarkontaminationen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden.</li>
	<li>Decken Sie das Heizkissen mit einem sterilen Blatt ab. Bringen Sie die Maus zur Operationsbank und legen Sie sie auf das sterile Blatt, wobei Sie die rechte seitliche Seite der Maus in Richtung Mikroskop zeigen. Halten Sie eine konstante Pad-Temperatur von 37 °C mit zirkulierendem Wasser aufrecht.</li>
	<li>Öffnen Sie den sterilisierten Beutel mit allen chirurgischen Geräten. Machen Sie mit einem Seziermikroskop und einer sterilen scharfen Schere einen kleinen Flankenschnitt (nahe der 13. Brustrippe, die letzte Rippe bei der Maus) und etwa 0,5 cm von den Wirbeln entfernt. Gehen Sie entlang der Lendenwirbel und machen Sie einen 1-Zoll-Einschnitt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut und den Muskel zurück, um die Niere freizulegen.</li>
	<li>Reinigen und entfernen Sie das umgebende Fett mit sterilen Wattestäbchen, um die Nierenarterie zu isolieren. Isolieren Sie den Nierennerv mit einer gekrümmten Pinzette von der Nierenarterie.</li>
	<li>Wenn Sie die Scheinoperation durchführen, legen Sie Nähte an, um die Haut zu schließen, und tragen Sie ein Antibiotikum auf die geschlossene Wunde auf, dann fahren Sie mit der postoperativen Pflege fort. Wenn nicht, fahren Sie mit dem folgenden Abschnitt fort, um die Arterie zu stenosieren. HINWEIS: Jedes Experiment sollte Scheintiere als Kontrollen des chirurgischen Eingriffs haben. Scheintiere bestehen aus Mäusen, die den chirurgischen Eingriff durchlaufen haben, bei dem die Nierenarterie freigelegt wurde, ohne eine Manschette darauf zu legen.</li>
</ol>2. Rechtsrenarterienstenose
<ol><li>Legen Sie zwei Nylonnähte unter die rechte Nierenarterie, machen Sie lose Knoten und legen Sie dann die Manschette um die Hauptnierenarterie ungefähr gleich weit entfernt zwischen Niere und Aortenbifurkation</li>
	<li>Schließen Sie die Manschette mit den Nylonnähten. Machen Sie vier Knoten für jede Naht, um die Wahrscheinlichkeit zu vermeiden, dass die Nähte nach der Operation verloren gehen.</li>
	<li>Schließen Sie den Schnitt im Muskel, indem Sie eine einfache durchgehende Naht anwenden.</li>
	<li>Machen Sie einfache unterbrochene Nähte, um die Haut zu schließen.</li>
	<li>Verabreichen Sie IACUC-zugelassene Analgetika. HINWEIS: Autoklavieren Sie chirurgische Instrumente vor jedem Gebrauch. Wenn mehr als eine Operation gleichzeitig durchgeführt wird, wischen Sie alle verwendeten Werkzeuge mit einem sterilen Alkoholmessgerät ab und legen Sie sie nach jeder Operation für 15-30 s in einen heißen Keimer. Wechseln Sie sterile Handschuhe auch für jede Maus.</li>
</ol>3. Nachsorge
<ol><li>Bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und lassen Sie den Käfig halb an, halb aus, ein zirkulierendes Wasserheizkissen für 2 - 3 Stunden. Fügen Sie Gel-Diät-Erholungsnahrung in den Käfig ein.</li>
	<li>Schmerzmittel (Ketoprofen) intraperitoneal (Dosis: 5 mg/kg Körpergewicht) am nächsten Tag verabreichen.</li>
	<li>Wiegen Sie die Mäuse für die nächsten zwei Tage; Wenn einige Mäuse mehr als 20% ihres Gewichts verlieren, konsultieren Sie den Tierarzt und entscheiden Sie, ob das Tier nach dem entsprechenden IACUC-zugelassenen Verfahren eingeschläfert werden muss.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse täglich, um Rötungen, Schwellungen, Schmerzen oder Infektionen zu beurteilen.</li>
	<li>Suchen Sie tierärztliche Beratung für postoperative Komplikationen in Übereinstimmung mit den institutionellen IACUC-Richtlinien.</li>
</ol>4. Gewebeentnahme
<ol><li>Gewebe 3 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff entnehmen. Notieren Sie das Gewicht jeder Maus.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Maus mit einem IACUC-zugelassenen Verfahren.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine sterile Plattform, um sie zu sezieren.</li>
	<li>Sichern und strecken Sie die Gliedmaßen, um die Bewegung einzuschränken.</li>
	<li>Besprühen Sie die Mäuse gründlich mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinienschnitt, um den Bauch und den Brustbereich mit einer scharfen Schere zu öffnen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut und die Peritonealwand zurück.</li>
	<li>Belichten Sie vorsichtig das Herz und punktieren Sie den rechten Ventrikel und entbluten Sie die Maus.</li>
	<li>Entfernen Sie beide Nieren mit einer Pinzette. Nieren befinden sich auf dem Rücken der Mäuse. HINWEIS: Mischen Sie nicht beide Nieren. Achten Sie auf stenosierte, vorgetäuschte und kontralaterale Nieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nierenkapsel, reinigen Sie sie von jeglichem Fett und notieren Sie das Gewicht jeder Niere separat.</li>
	<li>Schneiden Sie einen Längsschnitt beider Nieren ab und fixieren Sie 4% PFA über Nacht bei 4 ° C, um später für die Paraffineinbettung verarbeitet zu werden, um eine In-situ-Hybridisierung (ISH) und Immunhistochemie (IHC) durchzuführen. Befolgen Sie die ISH- und IHC-Protokolle wie berichtet23,24.</li>
	<li>Isolieren Sie den Kortex der verbleibenden Niere und gefrieren Sie in flüssigem Stickstoff, um Western Blot durchzuführen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse bei -80 °C.</li>
	<li>Quantifizieren Sie Renin- und N-GAL-Ausdrücke mit Western Blot, wie in der Literatur 23,24 beschrieben.</li>
</ol>5. Statistik
<ol><li>Verwenden Sie Einweg- oder Zweiweg-ANOVA für Experimente mit drei oder mehr Bedingungen, gefolgt von Bonferroni-Post-hoc-Tests für Vergleiche zwischen einzelnen Gruppen. Betrachten Sie einen p-Wert gleich oder kleiner als 0,05 als signifikant. Verwenden Sie Software (z. B. GraphPad Prism 8.2), um alle statistischen Analysen durchzuführen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kashyap, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+CCR2+reduces+macrophage+influx+and+development+of+chronic+renal+damage+in+murine+renovascular+hypertension.">Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+inflammatory+biomarkers+after+renal+revascularization+in+atherosclerotic+renal+artery+stenosis.">Changes in inflammatory biomarkers after renal revascularization in atherosclerotic renal artery stenosis.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (9), 1437-1443 (2016).</li><li>Yerram, P., Karuparthi, P. 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Es werden keine Interessenkonflikte, finanziell oder anderweitig, von den Autoren erklärt.

Nierenarterienstenose ist eine wichtige Ursache für sekundäre oder resistente Hypertonie und Nierenschädigung 1,29. Das Goldblatt-Modell mit zwei Nieren (2K1C) wurde verwendet, um RAStenosis-induzierte renovaskuläre Hypertonie 1,17,18,19 zu untersuchen. Eine Reihe früherer Studien mit verschiedenen Tiermodellen haben gezeigt, dass ...

Die Nierenarterienstenose (RAStenosis) ist ein hartnäckiges Problem, von dem etwa 6% der Menschen über 65 und bis zu 40% der Menschen mit koronarer oder peripherer Gefäßerkrankung betroffen sind 1,2. Aktuelle Behandlungen für die Krankheit sind begrenzt; Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung der renovaskulären Hypertonie oder der resistenten Hypertonie, die durch RAStenosis induziert wird. Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist der Schlüsselweg, der an der Pathogenese der RAStenosis-induzierten Hypertonie oder der renovaskulären Hypertonie beteiligtist 3,4. Bekannte Therapien, die auf RAAS abzielen, wie ACE-Hemmer oder Angiotensin-Rezeptorblocker, lindern Bluthochdruck, müssen jedoch eingehend auf Nierenversagen und Hyperkaliämie untersuchtwerden 5,6,7. Renin katalysiert den ratenbegrenzenden Schritt in RAAS; es wandelt Angiotensinogen in Angiotensin I um. Bei Atherosklerose verursacht die Bildung von Plaque die Verengung der Nierenarterie, die die Reninsekretion antreibt, was zu renovaskulärer Hypertonie und Nierenschäden führt8. Eine Reihe von Studien berichtete über erhöhte oxidative Belastungen während der renovaskulären Hypertonie beim Menschen, die mit dem Modell der zwei Nieren One Clip (2K1C) Mäuse sowie anderen hypertensivenTiermodellen 2,9,10,11,12,13,14,15,16 bestätigt wurden. . Der molekulare Mechanismus der Reninexpressionskontrolle während der RAStenosis-induzierten renovaskulären Hypertonie ist nicht gut verstanden und rechtfertigt weitere Untersuchungen.
Experimentelle Tiermodelle, die RAStenosis zuverlässig und reproduzierbar rekapitulieren, sind wichtig, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Renin-Expressionskontrolle für die Entwicklung neuartiger Therapien aufzuklären. Das 2K1C-Mausmodell ist ein etabliertes experimentelles Modell zur Untersuchung der Pathogenese der renovaskulären Hypertonie17,18,19,20. Dieses Modell wird durch die Verengung der Nierenarterie unter Verwendung eines Clips 17,20,21 erzeugt, wodurch ein Nierenarterienverschluss erzeugt wird, der zu einer Erhöhung der Reninexpression und Hypertonieführt 17,19,20,21. Es liegen jedoch keine technischen Berichte vor, die ein schrittweises Vorgehen zur Erzeugung einer Nierenarterienstenose im Tiermodell beschreiben.
Herkömmliche U-förmige Silberclips, Polyurethanröhrchen und andere Clips wurden verwendet, um die Nierenarterie zu verengen, um eine Nierenarterienstenose zu induzieren. Einige Studien haben gezeigt, dass das Design und das Material des Clips entscheidend sind, um zuverlässige und reproduzierbare Daten mit dem 2K1C-Tiermodell zu erhalten. Laut Lorenz et al. induziert die Verwendung herkömmlicher U-designter Silberclips eine niedrige Erfolgsrate von Bluthochdruck (40-60%)21. Aufgrund des Clip-Designs wird die Nierenarterie seitlich gedrückt, was einige Verengungen und eine größere Wahrscheinlichkeit auslöst, von der Nierenarterie entfernt zu werden. Silberformbarkeit und Duktilität können Änderungen der Clipbreiten ermöglichen; Daher verursacht dies unterschiedliche Hypertoniewerte bei Mäusen. Silberdioxid auf dem Clip kann perivaskuläre Entzündungen, Intimproliferation und Gewebegranulation verursachen und den Durchmesser der Nierenarterieverändern 22. Aufgrund der Variabilität der Hypertoniegrade, die mit dem herkömmlichen U-Design-Silberclip erzielt wurden, haben Warner et al. und Lorenz et al. erfolgreich einen Polyurethanschlauch mit runderen Design verwendet, um eine Nierenarterienstenose bei Mäusen einzuleiten, wodurch eine zuverlässigere und konsistentere Induktion des Tiermodells20,21 mit zwei Nieren erzeugt wurde.
In diesem Bericht beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll zur Erzeugung einer experimentellen RAStenose bei Mäusen, wobei der Polyurethanschlauch verwendet wird, um die Nierenarterie zu verengen. Die Polyurethan-Manschette mit rundem Design ist ein reproduzierbarerer, zuverlässigerer und kostengünstigerer Clip zur Erzeugung von Stenosen bei Mäusen. Ziel dieses experimentellen Modells ist es, den molekularen und zellulären Mechanismus der Reninexpressionskontrolle während der Nierenarterienstenose zu untersuchen und zu definieren. Wir bestätigten den Erfolg des RAStenosis-Mäusemodells durch Messung der Reninexpression und des Nierenverletzungsmarkers neutrophiles Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (N-GAL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diet Gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>Diet-Gel 76A</td>
			<td>Surgery recovery diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMC Heated Hard pad</td>
			<td>Hallowell</td>
			<td>000A2788B</td>
			<td>Heating pads were used to keep mice warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon Nylon Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>662G</td>
			<td>4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon Nylon Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>2815 G</td>
			<td>8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>GER 5287</td>
			<td>Sterilize surgical tools between surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>Ketofen</td>
			<td>Painkiller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane</td>
			<td>Braintree Scientific Inc.</td>
			<td>MRE-025</td>
			<td>This tube was used to initiate stenosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine antiseptic swabsticks</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901</td>
			<td>It was applied after hair removal and surgery on the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 Clip Applier</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td>204-1000</td>
			<td>This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td>It was used as a bedsheet for mice during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Medi-First</td>
			<td>22312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water pump</td>
			<td>Stryker</td>
			<td>T/pump Professionals</td>
			<td>Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified two kidney one clip mouse model of renin regulation in renal artery stenosis

Nierenarterienstenose ist eine häufige Erkrankung bei Patienten mit koronarer oder peripherer Gefäßerkrankung, bei der das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) überaktiviert ist. In diesem Zusammenhang kommt es zu einer Verengung der Nierenarterien, die eine Erhöhung der Expression und Freisetzung von Renin, der geschwindigkeitsbegrenzenden Protease bei RAAS, stimuliert. Der daraus resultierende Anstieg der Reninexpression ist ein bekannter Treiber der renovaskulären Hypertonie, die häufig mit Nierenschäden und Endorganschäden einhergeht. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung neuartiger Behandlungen für diese Erkrankung. Der molekulare und zelluläre Mechanismus der Reninkontrolle bei Nierenarterienstenose ist nicht vollständig verstanden und erfordert weitere Untersuchungen. Um eine Nierenarterienstenose bei Mäusen zu induzieren, wurde ein modifiziertes 2-Nieren-1-Clip (2K1C) Goldblatt-Mausmodell entwickelt. Die rechte Niere wurde bei Wildtyp-Mäusen stenosiert und scheinoperierte Mäuse wurden als Kontrolle verwendet. Nach Nierenarterienstenose bestimmten wir die Reninexpression und Nierenschädigung. Nieren wurden geerntet, und frische Kortices wurden verwendet, um die Protein- und mRNA-Expression von Renin zu bestimmen. Dieses Tiermodell ist reproduzierbar und kann verwendet werden, um pathophysiologische Reaktionen, molekulare und zelluläre Signalwege zu untersuchen, die an renovaskulärer Hypertonie und Nierenschäden beteiligt sind.

Die Verengung der Nierenarterien erhöht die Reninexpression in der stenosierten Niere und unterdrückt die Expression in der kontralateralen Niere. Das Zwei-Nieren-Eins-Clip (2K1C) oder Goldblatt-Modell der Stenose induziert eine erhöhte Reninexpression und Nierenschädigung. Dies gilt als das beste repräsentative Modell der einseitigen Nierenarterienstenose beim Menschen.
Die Expression von Renin und Prorenin (Vorstufe von Renin) wurde mittels Immunoblotting gemessen. Die Daten zeigen, da...

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A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

Ein modifiziertes Goldblatt-Mausmodell mit 2 Nieren 1 Clip (2K1C) wurde unter Verwendung von Polyurethanschläuchen entwickelt, um eine Nierenarterienstenose einzuleiten, die eine Erhöhung der Reninexpression und Nierenschädigung induziert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung und Platzierung der Manschette auf der Nierenarterie, um ein reproduzierbares und konsistentes 2K1C-Mausmodell zu erstellen.

Ein modifiziertes Zwei-Nieren-One-Clip-Mausmodell der Reninregulation bei Nierenarterienstenose

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

4.5K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center. Ein modifiziertes Goldblatt-Mausmodell mit 2 Nieren 1 Clip (2K1C) wurde unter Verwendung von Polyurethanschläuchen entwickelt, um eine Nierenarterienstenose einzuleiten, die eine Erhöhung der Reninexpression und Nierenschädigung induziert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung und Platzierung der Manschette auf der Nierenarterie, um ein reproduzierbares und konsistentes 2K1C-Mausmodell zu erstellen.

Serie: A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Die Verwendung eines Hanging-weight-System für Isolated Nierenarterie Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Forschung

Medizin

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Murine Nierentransplantations Technik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Maus-Modell für die Bauchspeicheldrüse Transplantation mit einer modifizierten Manschette-Technik

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Eine effiziente Methode der Absiebung, intakten Glomeruli von Erwachsenen Ratte Niere zu isolieren

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

Direkte Medikamentenabgabe an die Niere über die Nierenarterie

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...