Dieses individuelle menschliche Audiomodell nutzt relevante Immunzellen als leistungsfähiges Werkzeug, um die akute Immunantwort von Substanzen wie Nanomaterialien und Wissensmedikamenten vorherzusagen. Diese Mediziner kombinieren menschliche Epithelzellen und menschliche primäre Immunzellen, um diese spezifischen Reaktionen zu bewerten. Die Verwendung von frischen und gefrorenen Monozyten bietet Flexibilität für den Experimentierplan.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass dieses Modell einen Einblick in die interstellare Kommunikation zwischen Verhaltenssinn und Immunsinn geben kann. Da diese Demo alle wichtigen Details zum Anstollen des Modells als persönlicheEigenschaft in der Zellkultur enthält, werden visuelle Anweisungen zum Replizieren von Experimenten angezeigt. Mehrere Schritte im Blasenprotokoll sind komplex und erfordern eine besondere Handhabung.
Daher werden sie mit allen erforderlichen Details demonstriert, dass sie leicht befolgt werden können. Zur Isolierung von peripheren Blutmonozyten von menschlichen Buffy-Schichten, teilen Sie die Ernte Buffy Mantel Beutel Inhalt, gleichmäßig zwischen 250 Milliliter konische Röhren. Bringen Sie vorsichtig das Gesamtvolumen in jede Röhre 250 Milliliter mit PBS und mischen Sie die Rohre mit drei sanften Inversionen.
Dann teilen Sie die Buffy-Beschichtung PBS-Lösung gleichmäßig zwischen vier neuen 50-Milliliter-Röhren auf, fügen Sie dann 10 Mikroliter CD 14 positive magnetische Perlen die siebten Gesamtzellen in das Rohr und mischen Sie gut durch Pipettieren. Nach dem Befüllen die Pipette vom Pipetter lösen und sofort die obere Öffnung der Pipette mit einem Daumen stecken, dann die gefüllte Pipette an der Unterseite eines Rohres platziert und die Pipettenöffnung abziehen, damit dichtegradient mittel langsam unter die buffy Schicht PBS-Mischung fließen kann, bis ein Milliliter des Dichtegradientenmediums in der Pipette verbleibt. Wenn jedem Rohr ein Dichtegradientenmedium auf die gleiche Weise hinzugefügt wurde, trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und verwenden Sie eine serologische Pipette, um die weiße zwei bis drei Millimeter dicke periphere mononukleäre Blutzellschicht zwischen dem Plasma und den mittleren Schichten des Dichtegradienten zu sammeln.
Der beste Weg, die Schicht zu verbinden, ist, zuerst das Plasma zu entfernen und dann unsere logischen Pipetten zu unterdrücken, um die Zellen zu sammeln. Ziehen Sie die peripheren mononukleären Blutzellen aus jedem Satz von zwei Röhren in eine neue 50-Milliliter-Röhre und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Dann überstand und die Pipette in jeweils fünf Millilitern frischer PBS wieder aufhängen und die Zellsuspensionen zum Zählen in ein einziges Rohr bündeln.
Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Zählen wieder und setzen Sie die Pelette auf 80 Milliliter magnetischen Trennpuffer pro Uhr auf die siebten Zellen aus. Dann fügen Sie 10 Mikroliter CD 14 positive magnetische Perlen pro Besuchen Sie die siebte Gesamtzellen in das Rohr und mischen sie gut durch Pipettieren. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius spülen Sie eine magnetische Säule mit drei Millilitern magnetischen Trennpuffer und fügen Sie die Zellen zur Säule hinzu.
Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Milliliter Puffervolumen pro Waschgang und übertragen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Rohr, das einen Milliliter frischen magnetischen Trennpuffer enthält. Verwenden Sie dann den Kolben und fünf Milliliter Puffer, um die CD 14-positiven Zellen in die Röhre zu spülen. Induzieren Sie eine Differenzierung der magnetischen, magnetisch isolierten CD 14-positiven Zellen.
Erstens, resuspendieren die Zellen zu einem Mal kümmern sich um die sechs Zellen pro Milliliter Konzentration in Zellkultur Medium. Oder MDDC-Differenzierung, fügen Sie 10 Nanogramm pro Milliliter und von Granula-Site Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor in die Röhre und fügen Sie drei Milliliter Zellen zu jedem Brunnen einer sechs Brunnen-Zell-Kulturplatte, oder MDM-Differenzierung fügen 10 Nanogramm pro Milliliter Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor zu den Zellen und Platte die Zellen, wie gerade gezeigt. Um ein menschliches Alveolar-Epithelzellgewebe-Dreizell-Kokulturmodell einzurichten, übertragen Sie zunächst 1,5 Milliliter vorwarmer Zellkulturmedium in die entsprechende Anzahl von Wells einer 12-Well-Platte und legen Sie einen Zellkultureinsatz in jeden Brunnen.
Als nächstes 500 Mikroliter Epithelzellsuspension mit einer Dichte von fünf mal 10 zu den fünften Zellen pro Milliliter in die apikale Seite jedes Einsatzes geben und die Platte für eine viertägige Inkubation im Zellkultur-Inkubator bedecken. Oder MDDC-Saat ersetzt Überstand aus den Brunnen von sechs Brunnenplatten, die für die MDDC-Differenzierung verwendet werden, durch ein Milliliter frisches warmes Zellkulturmedium und verwendet einen Zellschaber, um die Haftzellen von jedem Brunnen zu lösen. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit dem Supernate und in jedem Brunnen und kombinieren Sie alle Zelllösungen zu einem einzigen Zentrifugenrohr.
Die geerntete MDDC durch Zentrifugation und sterile Pinzette, um die Einsätze aus den 12 Brunnenplatten kopfüber in einer sterilen Petrischale zu platzieren. Kratzen Sie alle Epithelzellen von der Basalseite des Inserts und suspendieren Sie die MDDCs im Frischzellkulturmedium und machen Sie eine Konzentration von 4,2 mal 10 dieser Zellen pro Milliliter. Dann fügen Sie 150 Mikroliter Zellen auf jeden Einsatz, so dass die gesamte Basaloberfläche des Einsatzes ist gleichermaßen mit der Flüssigkeit ohne Blasen bedeckt.
Für die MDDM-Saat nach der Ernte der differenzierten MDDMs, wie für die MDDCs demonstriert, verdünnen Sie die Zellen auf 2,5 mal 10 auf die vier Zellen pro Milliliter Frischzellkultur mittlerer Konzentration und fügen Sie 500 Mikroliter Zellen an der Wand jeder Epithelzelle und MDDC mit Zellkultureinsatz hinzu, dann legen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag aspirieren Sie den Überstand sowohl aus den apikalen als auch aus den Basalbereichen jeder Zellkultureinfügung und Wells. Dann sterilisieren Sie Pinzette, um die Einsätze aus den Brunnen zu heben und fügen Sie 600 Mikroliter frische Vorwärme zu Zellkultur Medium zu jedem Brunnen.
Nach sechs Tagen Differenzierung erscheinen die MDMs rund in Form, während MDDCs Cluster bilden, die aus Zellen mit einer längeren Form und beobachtbaren Vorsprüngen bestehen. Nach drei Tagen Wachstum auf Membraneinsätzen bilden die Epithelzellen eine dichte signifikante Erhöhung der Laktatdehydrogenasefreisetzung wird im Zellkulturmedium des Basalkomdes bei Exposition gegenüber einer positiven Kontrolle für Membranbruch beobachtet, was die Reaktionsfähigkeit des Modells auf eine zytotoxische Substanz beweist. Keine Erhöhung der Laktatdehydrogenase-Freisetzung, gemessen bei apikaler Stimulation mit TNF alpha oder LPS.
Statistisch signifikante Zunahmen der Freisetzung von IL6 und IL8 werden sowohl in LPS- als auch in TNF-Alpha-behandelten Proben beobachtet, verglichen mit der Kontrolle unbehandelter Zellen. Es werden keine Unterschiede in der Zellmorphologie zwischen den Co-Kultur-Modellen mit MDDMs und MDDCs aus frischen peripheren Blutmonozyten beobachtet, verglichen mit denen, die aufgetaute Zellen in LPS und TNF alpha-exponierte Kokultur verwenden, eine gestörte Epithelschicht wurde beobachtet. Es ist möglich, andere Arten von menschlichen Zellen wie Atemwege oder Bronchiolarzellen zu verwenden, andere Endpunkte können auch analysiert werden.
Hauptsächlich Forscher wurden von dieser Technik mit einem ähnlichen wie eingerichtet, aber mit verschiedenen Zelltypen inspiriert.
