The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Link&#246;ping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Link&#246;ping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.

Hinweis: Menschliche periphere Blut von gesunden Blutspendern anonym an der Blutbank der Linköping University Hospital gekauft wurde Schweden als Quelle der Immunzellen für diese Studie verwendet. Dieses Protokoll wird für 24 mm 6-Well-Platte Einsätze konzipiert. Direkte Anpassung an andere Formate auch nicht, da die Gewebemusterverträge vertikal und horizontal während der Entwicklung empfohlen. 1. Herstellung von Materialien, Medien und Kultur der Bakterien / Zelllinien <ol><li> Bakterienkultur: <ol><li> Wachsen die Mykobakterien-Stamm M. tuberculosis H37Rv tragenden pFPV2 Plasmid zu exprimieren konstitutiv das grün fluoreszierende Protein (GFP), in Middlebrook 7H9-Medium, das 0,05% Tween-80, 0,5% Glycerin, Kanamycin (20 ug / ml), ergänzt mit Middle Albumin, Dextrose und Anreicherung Katalase ( Middle ADC Enrichment), bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage. Hinweis: Alle Versuchsschritts mit Live-virulenten M. tuberculosis-Stämme sollten in einem BSL-3-Anlage durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung 1x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) vollständigem Medium (ergänzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS)). Bereiten Sie auch antibiotikafreies DMEM Vollmedium. </li><li> 1fach Minimum Essential Medium (MEM) vollständigem Medium (1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 10% hitze inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)). </li><li> Herstellung von Fibronektin / Collagen-beschichteten Kolben (insgesamt 10 ml): <ol><li> Pipette 8,8 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein sauberes Röhrchen. 1 ml Rinderserumalbumin (1 mg / ml), 100 ul Typ I Rinderkollagen (3 mg / ml) und 100 ul rekombinanter human Fibronectin (1 mg / ml). </li><li> Mischen Sie die Lösung durch Drehen des Rohres Upside-Down-5-mal. Kolben werden mit Fibronectin / Kollagen-Lösung (für eine T-25 und 2 ml für eine T-75-Kolben 1 ml) beschichtet. Lassen Sie es O / N bei 37 ° C. Nach der Inkubation, entfernen Sie die Lösung und speichern die beschichteten Kolben bei RT. Anmerkung: Die gesammelte Lösung kann bei 4 ° C gelagert und dreimal wiederverwendet werden. Lagerung für mehr als 2 Wochen können die Flüssigkeits bis braun (Kristallbildung), wobei auf sie weggeworfen werden muß drehen. </li></ol></li><li> Kultur von Fibroblasten: <ol><li> Aufbau und zur Pflege MRC-5, (eine humane Lungenfibroblasten-Zelllinie von normalem Lungengewebe eines 14 Wochen alten männlichen Fötus stammen), in vollständigem DMEM in 5% CO 2 bei 37 ° C. Verwenden Sie die Fibroblasten an Passagen 24-26 und wachsen, bis 70-80% konfluent. Hinweis: MRC-5-Zelllinie bei Durchgang&gt; 30 sind in der Regel, um die Morphologie zu verlieren und ist nicht für die Verwendung in der Gewebemodell empfohlen. </li></ol></li><li> Kultur von Epithelzellen:<ol><li> Erhalten 16HBE14o- (16HBE), einer immortalisierten menschlichen bronchialen Epithelzellen Zelllinie, die das differenzierte Morphologie und Funktion des normalen menschlichen Atemwegsepithelien behält, (dies war ein Geschenk von Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Francisco , USA. 10). Kultur 16HBE Zellen in Fibronectin / Collagen-beschichteten Kolben und Aufrechterhaltung der Zellen in komplettem MEM in 5% CO 2 bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von 5x DMEM <ol><li> Vorbereitung 5x DMEM durch Auflösen von 13,4 g DMEM-Pulver und 3,7 g Natriumbicarbonat in 150 ml steriles destilliertes Wasser. Der pH-Wert des Mediums auf 7,3, auf ein Volumen von 200 ml und filtern es mit 0,22 um Membranfilter. Sammeln des gefilterten Mediums in einem sterilen Behälter und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Kollagen eingebetteten Fibroblasten <ol><li> Tauwetter gefrorenen Teilmengen von FBS und L-Glutamin in einem 37 ° C Wasserbad.Nach dem Auftauen halten die Proben auf Eis. Platzieren Natriumbicarbonat (71,2 mg / ml) und Gentamicin (50 mg / ml) bei 4 ° C. Pre-cool 50 ml Zentrifugenröhrchen und 10 ml sterilen Pipetten bis 4 ° C. Anmerkung: Alle eingesetzten (mit Ausnahme des 5x DMEM) Materialien werden auf Eis vor der Verwendung gekühlt und alle Schritte werden auf Eis durchgeführt. Typ-I-Kollagen (1,1 mg / ml) muß kühl gehalten werden, da dies verhindert, dass die Verfestigung des Kollagens. </li><li> Bereiten Sie die Fibroblasten: <ol><li> Warm Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren ausreichender Menge mit Lungenfibroblasten (MRC-5-Zellen) für 10 min bei 5% CO 2 bei 37 ° C. Neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von DMEM 1x komplett. Saugen Sie das Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Zellen bei 2,3 × 10 5 Zellen / ml in DMEM-Voll. Legen Sie die Zellen auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Pre-Mix: <ol><li> Fügen Sie den folgenden in ein Röhrchen &quot;Pre-Mix&quot; gekennzeichnet; 395ul 5x DMEM, 40 &amp; mgr; L-Glutamin, 120 &amp; mgr; l NaHCO 3 (71,2 mg / ml), 440 ul FBS, 5 &amp; mgr; l Gentamicin (50 mg / ml), Volumen gesamt 1.000 &amp; mgr; l, dann wirbeln die Vormischung gut und legte auf Eis. Hinweis: Die angegebenen Volumina sind für einen 24 mm 6-Well-Kultureinsatzes. Berechnen Sie die für die Gesamtzahl der Einsätze erforderlichen spezifischen Mengen, aber fügen Sie eine zusätzliche, um sicher zu sein, ist genug Vormischung vorbereitet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die azellulären Kollagenmischung: <ol><li> Zu jeder Kultur 1 ml azellulären Kollagenmischung. Fügen Sie den folgenden, um einen 50 ml konischen Röhrchen auf Eis in der angegebenen Reihenfolge; 686 &amp; mgr; l von 1,1 mg / ml Kollagen, 250 ul Pre-Mix und 64 ul 1x komplettem DMEM zu einem Gesamtvolumen von 1000 &amp; mgr; l. Mischen Sie die Lösung auch die Gewährleistung und keine Luftblasen. Arbeiten Sie schnell und fügen Sie die Collagen an der Wand der Röhre, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> 1 ml des zellfreien Schichtmischung an dem Einsatz in der Platte mit 6 Vertiefungen gelegt. Nicht jedes Medium zu der auch hinzufügen nicht außerhalb des Einsatzes. Imcubate für 30 min in einem 37 ° C Inkubator. Stellen Sie sicher, die azellulären Mischung umfasst den gesamten Einsatz ohne Luftblasen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Mobil Kollagen-Mischung: <ol><li> Mischungskomponenten der Zellschicht in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis in der folgenden Reihenfolge gehalten werden; 2 ml Collagen, 615 &amp; mgr; Pre-Mix, 58 &amp; mgr; l 1x komplettes DMEM und 327 &amp; mgr; l Zellsuspension Lungenfibroblasten (MRC-5) bis zu 3.000 ul bilden das Gesamtvolumen. Jede Kultur erfordert 3 ml der Zell Kollagen-Mischung. Entscheidender Schritt: Stellen Sie sicher, das Kollagen und Vormischung sorgfältig vor Zugabe der Zellsuspension mischen. Dadurch wird der pH-Wert der Kollagen neutralisieren toxische Wirkung auf die Fibroblasten zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen der Zellschicht (3 ml) auf der Oberseite des azelluläre Kollagenschicht und Inkubation für 2 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. Arbeiten Sie schnell und fügen Sie die Collagen an der Wand der Röhre, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Nach der Polymerisation 2 ml DMEM Komplett bis ter unten auf der 6-Well-Platte (unter der Einlage) und 24 h inkubiert. HINWEIS: Wenn die Polymerisation trat nicht auf, entsorgen Sie die Platteneinsätze, die das Fibroblasten-Kollagenmatrix und Inbetriebnahme immer wieder. Der wahrscheinlichste Grund ein Fehler in der Addition oder falscher Volumen von einem der oben genannten Reagenzien. </li></ol></li></ol> 3. Kontinuierliche Kultur des Fibroblasten-Kollagenmatrix <ol><li> Heben Sie den Einsatz mit einem sauberen Pinzette und saugen Sie den Kulturmedien aus dem Boden des Bohrlochs. 2 ml komplettem DMEM mit dem Boden der Vertiefung, gefolgt von 2 ml komplettem DMEM innerhalb des Einsatzes. Vermeidung der Einführung von Luftblasen unter dem Einsatz, da dies die Diffusion von Nährstoffen zwischen den äußeren und inneren Kammern zu verhindern. Entfernen Sie Luftblasen mit einer Mikropipettenspitze. </li><li> Ändern Sie den Kulturmedien (innerhalb und unterhalb des Einsatzes) jeden zweiten Tag und Kultur für etwa 5-7 Tage. Achten Sie darauf, in der Sie das Medium aus dem Einsatz. Um zu vermeiden, contact mit dem Fibroblasten-Kollagenmatrix, leicht kippen Sie den Einsatz mit einem sauberen Pinzette und saugen Sie den Datenträger aus den Einsatzwänden. Entscheidenden Schritt: Die Fibroblasten in der Kollagenmatrix sollte eine längliche Phänotyp zu bekommen, und renovieren das Kollagen, die dann Aufträge. In etwa 5-7 Tagen hat sich die Matrix zusammengezogen, um eine Plattform (10-14 mm im Durchmesser) in der Mitte des Einsatzes zu bilden. Die vertraglich Matrix ist bereit für den Einsatz in der nächsten Schritt. Um eine gleichmäßige Kontraktion der Matrix ist es entscheidend, zu erhalten, dass die Fibroblasten sind gut mit dem Kollagen vor der Aussaat (Schritt 2.6.1) gemischt. </li></ol> 4. Setzen von Immunzellen (Infizierte / Nicht infizierte Monozyten-Makrophagen-Gemisch) Hinweis: Die folgenden experimentellen Schritte beinhalten virulenten Mykobakterien und müssen daher in einer BSL-3-Anlage durchgeführt werden. <ol><li> Herstellung von primären Monozyten und Makrophagen: <ol><li> Isolieren Monozyten im peripheren Blut von Spenderblut mit Hilfe eines establiSchuppen-Protokoll. Isolieren Monozyten am selben Tag wie die Einrichtung des Gewebemodells und Kultur und differenzieren sich zu Makrophagen etwa 7 Tage vor der Infektion mit M. Tuberkulose. HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, sowohl die Makrophagen und die vertraglich Fibroblasten-Kollagenmatrix sind nach 7 Tagen zur Verfügung. Auch isolieren frischen Monocyten, die zusammen mit den infizierten Makrophagen aufgenommen wird. </li></ol></li><li> Herstellung von M. Tuberkulose infizierten Makrophagen <ol><li> Ernten Sie die kultivierten Bakterien, wäscht mit 1x PBS mit 0,05% Tween-80, resuspendieren in antibiotikafreiem DMEM komplette, durchlaufen einen abgeschnittenen sterile 27 G-Nadel, um bakterielle Klumpen zu zerstreuen und messen die optische Dichte. Hinweis: Pre-Bestimmung der M. tuberculosis koloniebildende Einheit Mittel der optischen Dichte im Labor. Dies gibt eine Schätzung der Anzahl der Bakterien, für Infektion verwendet werden. </li><li> Die Makrophagen Inkubieren für 4 Stunden mit &lt;em&gt; M. Tuberkulose beim Multiplizität der Infektion (MOI) 10). Nach der Infektion waschen 3x mit 1x PBS, um die extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Verwenden uninfizierten Makrophagen in der gleichen Weise, aber ohne M. kultiviert Tuberkulose, als Kontrolle. </li><li> Trennen der mit Makrophagen von der Kulturplatte durch Behandlung mit 2 mM EDTA für 10 Minuten bei 37 ° C resuspendiert und die Zellen in antibiotikafreiem komplettem DMEM. </li></ol></li><li> Kennzeichnung von Monozyten Hinweis: Isolierung und Markierung von Monozyten in der BSL-2 Bank durchgeführt werden und dann in BSL-3 zur weiteren Verarbeitung entnommen. <ol><li> Fleck frisch hergestellten Monozyten (2 x 10 7 Zellen) mit einer Endkonzentration von 2 uM PKH26-Farbstoff für 5 min, nach den Anweisungen des Herstellers. Waschen 3x und Resuspendieren der Zellen, die mit antibiotikafreiem komplettem DMEM mit einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml. </li></ol></li><li> Zugabe von Immunzellen Fibroblasten Kollagenmatrix <ol><li> EINfter 5-7 Tagen Kultur der Fibroblasten-Kollagenmatrix absaugen Kulturmedien aus den äußeren und inneren Kammern und 1,5 ml frischer antibiotikafreies DMEM-Voll in die äußere Kammer. </li><li> Vorbereitung eines markierten Monozyten-Makrophagen (nichtinfizierten / infizierten) in Mischung mit einem Verhältnis von MO: MQ (5: 1) in 50 &amp; mgr; l DMEM-Voll. Für 50.000 Makrophagen zu nehmen 250000 markierten Monozyten. </li><li> Dann werden 50 ul MO: MQ Mischung auf die Fibroblasten-Kollagen-Matrix und Inkubation für 1 Stunde in 5% CO 2 bei 37 ° C. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml Kulturmedium in den Einsatz und Inkubation für weitere 24 h in 5% CO 2 bei 37 ° C. Hinweis: Da Zellen gegeben sind lose befestigt ist, sollte die Zugabe von Medien langsam durch vorsichtiges Hinzufügen von an den Wänden des Einsatzes sein. </li></ol></li></ol> 5. Setzen von Lungenepithelzellen (16HBE) Hinweis: Die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden. <ol><li> Seed Lungen epithelial Zellen (16HBE) auf der Oberseite der MO: MQ-Fibroblasten-Kollagenschicht. Um dies durchzuführen, erste dissoziieren 16HBE Zellen aus dem Kolben durch Behandlung mit Trypsin (wie in 2.2.1.) Und resuspendieren in 4 × 10 6 Zellen / ml in antibiotikafreiem DMEM. </li><li> Saugt den Kulturmedien innerhalb und außerhalb des Einsatzes. Dann fügen Sie 1,5 ml antibiotikafreies DMEM Komplett im Boden der Vertiefung außerhalb des Einsatzes. </li><li> Dann werden 50 ul 16HBE oben auf der Immunzelle-Fibroblasten Kollagenmatrix. Lassen Sie für 2 min in der Haube und Inkubation für 1 h bei 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Nach Inkubation geben vorsichtig 2 ml antibiotikafreies DMEM-Voll innerhalb des Einsatzes und die Kultur bei 37 ° C für 3 Tage. Die Kulturschritt erleichtert Proliferation von Epithelzellen in der Gewebemodell. Hinweis: Da Zellen gegeben sind lose befestigt ist, sollte die Zugabe von Medien langsam und sanft durch Gleiten durch die Wände des Einsatzes sein. </li></ol> 6. Luftexposition des 3D-LungModell Hinweis: Nach Tag 5 nach Zugabe von infizierten Makrophagen sind die Gewebemodelle Luft ausgesetzten und die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden. <ol><li> Saugt den Kulturmedien innerhalb und außerhalb des Einsatzes. Anmerkung: In diesem Schritt können die Überstände zum Nachweis von sezernierten Faktoren gesammelt werden. Zentrifuge, sterile Filter und speichern Überstände bei -70ºC. </li><li> Hinzuzufügen 1,8 ml antibiotikafreies DMEM-Voll in der äußeren Kammer und inkubiere in 5% CO 2 bei 37 ° C Inkubator für 2 Tage. Haben Kulturmedien hinzuzufügen nicht innerhalb des Einsatzes. HINWEIS: Die Luft Anheben des Gewebemodells erleichtert die Bildung von geschichteten Epithelien und Schleimsekretion, die die Festigkeit des Gewebes und physiologische Ähnlichkeit mit humanem Lungengewebe liefert. </li></ol> 7. Ernte und Montage des 3D Lungengewebemodell Hinweis: Die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden.<ol><li> Am Tag 7 nach der Implantation von infizierten Makrophagen sind die Gewebemodelle bereit für die Ernte. Entfernen Sie die Kulturmedien vollständig aus dem Gewebemodell. Befestigen Sie die Gewebemodell mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten im Dunkeln bei RT. Dieser Schritt tötet die Bakterien und fixiert das Gewebe / Zellmorphologie zur weiteren Verarbeitung. </li><li> Mit einem Skalpell, trennen Sie die Membran aus dem Brunnen Einsatz. Übertragen Sie die Membran in das Gewebe zu einer gut aus 1x PBS mit. </li><li> Schneiden Sie und entfernen Sie die Seiten des Gewebemodell mit einem sauberen Skalpell. Dann schneiden Sie die Gewebemodell in 4 ungefähr gleich große quadratische Stücke. Bringen Sie ein Stück Gewebe auf einen Glasobjektträger Superfrost. Die Gewebestücke in 1x PBS bei 4 ° C. </li><li> Trocknen Sie das Gewebe 5 min und montieren mit ProLong Gold-Antifade mit DAPI und Deckglas. Lassen Sie die Folien, ohne in der Dunkelheit zu stören bei RT bis trocken. Hinweis: Die Dicke des Gewebes zwischen dem Zentrum und Peripherie zu variieren, was zu leichten Tilting des Deckglases. Um dies zu vermeiden, kann ein Abstandshalter (zum Beispiel Parafilm) auf der Ecke des Deckglases gebracht wird. </li><li> Bewerben Nagellack auf die Ränder des Deckglases und trocknen lassen. Tauchen Sie die Objektträger in 70% Ethanol sie sicher aus dem BSL-3-Anlage zu bringen, um zu machen. </li></ol> 8. Visualisierung, Erfassung und Quantitative 3D Analyse <ol><li> Visualisieren die Gewebeschnitte mit einem konfokalen Mikroskopsystem mit Lasern bei 488 nm für die Anregung von GFP (grün-Kanal), 420 nm für DAPI (blau) und 555 nm für die PKH26-markierten Monozyten (rot) auf. </li><li> Erwerben 3D-Bilder mit einer Auflösung von 512x512 mit Z-Stapel abdeckt bei einem Minimum von 20 um Dicke und mit 1 bis 1,5 &amp; mgr; m Abstand zwischen den Stapeln. Erwerben 5-10 verschiedenen Bereichen, die den gesamten Gewebestück. Hinweis: Verwenden Sie die Konfiguration wie Nyqvist zur optimalen Einstellung der optischen Auflösung (Wellenlänge, Laserleistung / Belichtung, Pixelgröße und Zoom). Vermeiden Sie unDer oder Übersättigung von Pixeln. </li><li> Analysieren Sie die konfokale Bilder mit 3D-Bildverarbeitungs-Software. Für 3D-Quantifizierung von Zellclustern, werden die folgenden Schritte für eine optimale Analyse empfohlen. </li><li> Öffnen Sie die 3D-Bildverarbeitungs-Software, und laden Sie das Bild. Messung der Dimensionen von Objekten in dem Bild untersucht werden, beispielsweise die Größe eines Nukleus, individuelle Monozyten- und einzelne Bakterien. Diese Beobachtungen sind nützlich für die Definition oder Filterung der Objekte. </li><li> Wenn ein Wiedergabeanpassungstool optimieren Volume Rendering indem jeder Kanal für Bildkontrast, Helligkeit und Opazität zu mischen. Dieser Schritt ist, die Interferenz von Rauschen in Volume Rendering minimieren. Anmerkung: Die Gammakorrektur kann die Manipulation von Bildern führen und sollten daher vermieden werden. </li><li> Erstellen Sie Flächen, indem Sie den roten Kanal (Monozyten) und stellen Sie die Schwelle (automatische oder manuelle Auswahl). Falls erforderlich, verwenden Sie Filter, um die Auswahl von roten Monozyten zu beschränken oder die b auszuschließenintergrund. Ebenso erstellen Flächen für grün (M. tuberculosis) und Blau (Kerne) Kanäle, wie oben beschrieben. </li><li> Exportieren Sie die Daten in MS-Excel-Dateien. Es ist möglich, einen bestimmten Parameter oder alle Daten zu exportieren. Die Parameter, die für die Analyse von Zellclusterbildung relevant sind, sind Volumen, Intensität, Anzahl der Objekte, Anzahl der Voxel und Kugelgestalt. </li><li> Speichert und exportiert die Bilder in einem geeigneten Bildformat TIFF bevorzugt. HINWEIS: Animationen können auch mit dem Animationsmenü vorgenommen und als Medien-Datei gespeichert werden. </li><li> Speichern Sie die Analyse-Einstellungen der einzelnen Kanäle mit der Option Parameter hinzufügen und können später mit der Rebuild-Funktion abgerufen werden. Gleichzeitig analysiert mehrere Dateien mit Hilfe der Batch-Verarbeitung-Tool. Anmerkung: Alle zu vergleichenden Bilder erworben werden müssen, verarbeitet und in der gleichen Weise analysiert werden. Beispielsweise ein 8 Bit-Bild (256 integer) sollte nicht mit einem 12-Bit-Bild (4096 integer) verglichen werden. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model.">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis:+few+CD8++effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3++regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions.">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination. 
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9. 
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions. 
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11. 
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.

Bei Menschen, Antworten auf eine Infektion, Entzündung im Gewebe, Zellrekrutierung, Gewebeumbau und die Regulierung der Gewebehomöostase sind komplexe Veranstaltungen mit verschiedenen Zelltypen. Daher sind diese Verfahren am besten in der lokalen Gewebeumgebung untersucht. Bisher hat dies vor allem möglich unter Verwendung von experimentellen Tiermodellen. Jedoch die weit verbreiteten Versuchstieren halten viele Grenzen, da sie oft zu antworten Pathogenen in einer anderen Weise als Menschen und auch einen anderen Verlauf der Erkrankung 1 anzuzeigen. Ein menschlicher Lunge in vitro Gewebemodell hält der Möglichkeiten, um spezifische Immunantworten in der menschlichen Lunge zu untersuchen. Menschlicher Tuberkuloseinfektion (TB) ist hauptsächlich eine Erkrankung der Lunge. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), den Erreger der Tuberkulose, die Lunge über Aerosol-Tröpfchen, die an den Alveolarraum, wobei die Bakterien durch Lungen dendri verschlungen transportiert werden erreichttic Zellen und Alveolarmakrophagen als Teil der angeborenen Immunantwort auf die Infektion 2,3. Phagozytose der Erreger führt zur Abschottung des Fehlers innerhalb eines Phagosom und führt zur Neutralisation und Tötung des Erregers durch die Phagozyten ideal. Bis zu 50% der Personen, um M. ausgesetzt Tuberkulose wird angenommen, dass in der Lage, die Infektion durch die angeborene Immunantwort 4 klar sein. Weitere Ergebnisse der Infektion sind Freigabe durch das adaptive Immunsystem in einem späteren Stadium, latente Infektion oder im schlimmsten Fall chronisch aktiver Erkrankung 5. Zuvor gab es für das Studium der menschlichen TB wurden keine In-vitro-Gewebemodelle. Einzelzellkulturen von menschlichen Makrophagen oder andere Zellen des peripheren Blutes wurden häufig verwendet 6,7. Der Nachteil dieses Ansatzes ist, dass sie die Bewegungen der verschiedenen Zelltypen gleichzeitig zusammen in einem Lungengewebe zu M. ausgesetzt gewesen sein kann Tuberkulose </em&gt;. Somit besteht ein Bedarf nach einem in vitro-Modell, um funktionelle und mechanistische Studien über TB auszuführen. Die zellbasierten in vitro hier beschriebenen menschlichen Lungengewebe-Modell wurde ursprünglich von unserer Gruppe für Studien über dendritische Zellfunktionen 8 etabliert. Wir haben dieses Verfahren für die Untersuchung von TB angepasst. Das menschliche Lungengewebe Modell hier präsentierten aus gewebespezifischer Epithelzellen und Fibroblasten 8. Diese Zellen sind in einer Matrix aus Kollagen auf der Oberseite der porösen Membran in einem Transwell-Einsatz und bilden Strukturen ähnlich normalen menschlichen Lungengewebes (1) kultiviert. An der Luft beginnen die Zellen, um Schleim in der apikalen Seite 8 sekretieren. Durch Implantation von humanen primären Makrophagen, die mit M. infiziert tuberculosis zum Modell haben wir beobachtet, wie die Immunzellen wandern in das Gewebe und frühen Stadien der TB Granulome 9 bilden. Dies ist die erste menschliche Gewebemodell described für TB, und es stellt ein vielversprechendes Werkzeug für die Untersuchung angeborenen Immunantwort auf Tuberkulose und anderen Erkrankungen der Lunge. Bisher haben wir nur Monozyten und Makrophagen als Immunzellen im Modell verwendet, aber der Grad der Komplexität kann durch Aufnahme zusätzlicher relevanter Zelltypen erhöht werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Lungengewebes Modell. (A) wird das Modell der menschlichen Lunge spezifische Epithelzellen besteht, M. Tuberkulose infizierten primären Makrophagen und roten Farbstoff markiert Monozyten auf Kollagen eingebetteten Fibroblasten auf einem Transwell-Filter hergestellt ausgesät. Exposition der Gewebemodell, um Luft initiiert Produktion von extrazellulären Matrixproteinen, Schleimabsonderung und Schichtung nach dem Epithel. Das so entwickelte 3D-Gewebemodell ist ein nützliches Tool, um M. studieren tuberculosis-Infektion in einer Umgebung, die closely ähnelt einem menschlichen Lunge. (B) Repräsentative mikroskopische Bilder der verschiedenen Schritte bei der Herstellung der Gewebemodell. (C) die komplette Struktur des Lungenmodell Gewebeschnitt. Scale -. 100 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells, lung fibroblasts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATCC#CCL-171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16HBE cells, lung epithelial cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (5 x DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-082</td>
			<td>Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 &#181;m filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium with glucose (DMEM) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle&#8217;s salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution, 100x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (71.2 mg/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Heat inactivated for 30 min, 56 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50 mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer solution 1M</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield</td>
			<td>7801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Collagen PA treated (500 ml)</td>
			<td>Organogenesis</td>
			<td>200-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml)</td>
			<td>Advanced biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg)</td>
			<td>BD</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human monocytes/macrophages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human whole blood or buffy coats.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 medium&#160;</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td>
			<td>BBL</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin B sulfate (20 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin -EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection

Tuberkulose (TB) hält immer noch eine große Bedrohung für die Gesundheit der Menschen weltweit, und es besteht ein Bedarf an kostengünstigen, aber zuverlässigen Modelle, die uns helfen zu verstehen, die Krankheitsmechanismen und vorab die Entdeckung neuer Behandlungsmöglichkeiten. In-vitro-Zellkulturen von Monoschichten oder Co-Kulturen fehlen die dreidimensionale (3D) Umgebung und Gewebereaktionen. Hier beschreiben wir eine innovative In-vitro-Modell eines menschlichen Lungengewebe, das Versprechen hält, um ein wirkungsvolles Werkzeug für die Untersuchung der komplexen Ereignisse, die während einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) auftreten. Das Gewebemodell 3D besteht aus gewebespezifischer Epithelzellen und Fibroblasten, die in einer Matrix aus Kollagen auf der Oberseite einer porösen Membran kultiviert werden. Bei Lufteinwirkung die Epithelzellen stratify und sezer Schleim an der apikalen Seite. Durch die Einführung von primären humanen Makrophagen, die mit M. infiziert tuberculosis zur Gewebemodusl, haben wir gezeigt, dass die Immunzellen wandern in das infizierte Gewebe und frühen Stadien der TB Granulome bilden. Diese Strukturen rekapitulieren die besonderes Merkmal der menschlichen Tuberkulose, der Granulom, die sich grundlegend oder nicht gewöhnlich in weit verbreiteten experimentellen Tiermodellen festgestellt ist. Das organotypische Kultur Verfahren ermöglicht die 3D-Visualisierung und robuste quantitative Analyse, die entscheidenden Informationen über räumliche und zeitliche Merkmale der Wirtszelle-Pathogen-Interaktionen bietet. Zusammengenommen bietet das Lungengewebe-Modell einen physiologisch relevanten Gewebemikroumgebung für Untersuchungen an TB. Somit hat das Lungengewebe-Modell möglichen Auswirkungen auf sowohl grundlegende mechanistische und angewandten Studien. Wichtiger ist, ermöglicht das Modell zusätzlich oder Manipulation einzelner Zelltypen, die dadurch ihre Verwendung aufweitet zum Modellieren einer Vielzahl von Infektionskrankheiten der Lungen auf.

Ein 3D-Lungengewebe Modell für menschliche TB effektiv genutzt, um die Wirt-Pathogen-Interaktionen in M. zu studieren Tuberkulose-Infektion. Die grundlegenden Schritte dieses Verfahrens werden repräsentative mikroskopische Bilder verschiedener Stufen und einer Gesamt mikroskopische Struktur einer Gewebeschnitt in 1 dargestellt. Das Modell besteht aus mehreren Komponenten von humanem Lungengewebe, einschließlich Lungenfibroblasten, bronchiale Epithelzellen und primäre Monozyten / Makrophagen in der 3D-Gewebeumgebung eingebettet. Neben der Einbeziehung Komponenten der menschlichen Lungengewebe, das Modell ähnelt physiologischen Bedingungen zwar Schichtung der Epithelien und Schleimabsonderung. Ein Beispiel für die Verwendung des Lungengewebes Modell bei der Überwachung einer TB-Infektion ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Visualisierung der M. Tuberkulose-Immun-Zell-Migration und Interaktion führten wir Makrophagen, die mit M. infiziert Tuberkulose, die GFP exprimieren(grün) zusammen mit den frisch isolierten PKH26-markierten Monozyten (rot) in das Gewebe-Modell (blau, befleckt DAPI für Kerne). Am Tag 7 nach der Zugabe von M. Tuberkulose infizierten Zellen an den Gewebemodell, zeigt konfokale Mikroskopie Clustering von roten Monozyten an den Ort der Infektion (grün) (Abbildung 2), die das Markenzeichen Läsionen des menschlichen TB 9 nachahmt. Eine Reihe von repräsentativen Bildern für die 3D-Visualisierung von M. Tuberkulose infizierten Gewebemodell und Quantifizierung von Zellclustern ist in Abbildung 3 dargestellt. Die 3D-Visualisierung gibt dem Benutzer die Flexibilität, zu interagieren, zu untersuchen und zu quantifizieren, mehrere Funktionen in einem 3D-Bild. Die räumliche Anordnung der grünen und roten Bakterien Monozyten Cluster von der apikalen, Dreh- und Seitenansicht gesehen, wie in 3B, die Clusterbildung von Monozyten an der Stelle zeigt, M. illustriert Tuberkulose. Die Cluster nicht OBbei nicht infizierten Geweben (3A) serviert. Quantifizierten wir die Größe und Anzahl der Monozyten Zellcluster und festgestellt, dass die Größe (Volumen) von Zellclustern verbessert (p &lt;0,001), während die Anzahl der Einzel Monozyten verringert (p &lt;0,01) in M. Tuberkulose infizierten Geweben im Vergleich zu nicht infizierten Gewebemodelle (3C und 3D). Diese Daten bestätigt unsere frühere Feststellung der frühen Granulombildung in M. im Lungengewebe-Modelle in 2D Gewebeschnitte 9 analysiert Tuberkulose-Infektion beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die Gewebemodell bietet eine natürliche 3D-Lebensraum zu untersuchen, die komplexe Host-Zell-M. tuberculosis Kommunikationsnetz. Wir fanden auch, dass 3D-Visualisierung und quantitativen Analyse sind bessere Werkzeuge für die Untersuchung der Funktionen im Gewebe-Modell (Abbildung 3). Die Quantifizierung der Zellcluster (Granulom zum Beispiel) oft stretc<html> hes zu mehreren Zellschichten und kann vollständig durch eine quantitative 3D-Analyse erfasst werden. Außerdem Visualisierung der genauen räumlichen und zeitlichen Eigenschaften einzelner Zellen oder Bakterien im Modell ermöglichen Live-Bildgebung, Migration und Tracking-Studien in einem autorisierten Labor. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Abbildung 2. Monozyten im Gewebemodell Cluster rund virulenten M. Tuberkulose. Repräsentative konfokale Bilder von nicht infizierten und M. tuberculosis infiziert Gewebemodell wird vorgestellt. Panels von grün (M. tuberkulose- GFP), rot (PKH26-markierten Monozyten), blau (DAPI-gefärbten Zellkernen) und fusionierte Kanäle zeigen die Rekrutierung von Monozyten im infizierten Gewebe im Vergleich zu nicht infizierten Gewebe. Scale - 100 um.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Abbildung 3. 3D-Visualisierung und quantitativen Analyse von Gewebemodell nützliche Informationen. Repräsentative Bilder der 3D-Visualisierung des gesamten Gewebemodell (A) nicht infizierten Gewebe, (B) mit M. infiziert Tuberkulose, durch optische Schnitte mit Zeiss LSM700 konfokalen Mikroskop und quantitative Analyse von Imaris Bildverarbeitungs-Software (Version 7.6.8). Diese Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung erworben, 14 Z-Stapel bedeckt eine Gewebedicke von 19,5 &amp; mgr; m mit 1,5 um Abstand, so dass die Visualisierung von apikal, Rotations horizontale Dreh vertikale und seitliche Ansicht (A und B). (C) QuaGröße ntitative Analyse der Monozyten-Zellcluster offenbaren verbesserte (p &lt;0,0001) der frühen Granulom Clustern nach M. Tuberkulose-Infektion im Vergleich zur Abwesenheit von Infektion. (D) Quantifizierung der Zahl der Monozyten zeigten eine Abnahme (p &lt;0,01) im infizierten Gewebe im Vergleich zu nicht infizierten Gewebe wiederholte mehrere Cluster im infizierten Gewebe. Green - M. Tuberkulose -GFP, Rot - PKH26-markierten Monozyten, Blue - Zellkernen, Scale -. 100 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

18.7K Aufrufe.  Linköping University. Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Serie: A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

Influenza-A-Virus-Studien in einem Mausmodell der Infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...