Live-Cell Bdellovibrio bacteriovorus Bildgebung war aufgrund des komplexen Lebenszyklus dieser räuberischen Bakterien herausfordernd. Unser Protokoll ermöglicht die Überwachung der Phasen des gesamten Lebenszyklus in Echtzeit. Obwohl unser Protokoll auf einer spezifischen Ausgleichsstämme basiert, kann es leicht an eine Vielzahl von Bakterienstämmen angepasst werden, einschließlich pathogener Stämme.
Um eine B.bacteriovorus Kultur zu schaffen, kombinieren Sie einen Milliliter frischer 24-Stunden-Kulturbakterien mit drei Millilitern über Nacht-Beutekultur in einem 250-Milliliter-Kolben mit 50 MilliliterCalcium-Hippies, die bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt werden. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute überprüfen Sie, ob die Beutezellen vollständig durch eine flüssigkeitsmontierte Gesichtskontrastmikroskopie lysiert wurden. Zahlreiche multi-attackierte b.bacteriovorus Zellen sollten vorhanden sein und keine E.coli-Zelle oder Bdelloplast sollte sichtbar sein.
Die B.bacteriovorus Kultur durch einen 0,45 Mikrometer Poren-Filter in ein 50 Milliliter konisches Rohr abseihen und das Filtrat in einer Zentrifuge aussetzen. Dann setzen Sie das B.bacteriovorus Pellet in drei Milliliter Calcium Hippies auf eine endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,2 zurück und bebrüten die Bakterien bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Um die Wirtszellen vorzubereiten, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Wirtsstamm von Interesse und die Bakterien in 10 Milliliter YT Medium ergänzt mit Antibiotika, wie für eine Nacht inkubation bei 37 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute ergänzt.
Am nächsten Morgen zwei Milliliter der Nachtkultur in ein Zwei-Milliliter-Reagenzglas übertragen und die Zellen per Zentrifugation pellet. Dann das Pellet in 200 Mikroliter Kalzium Hippies Puffer wieder aussetzen. Es ist sehr wichtig, das gesamte Zellpellet nach der Zentrifugation vollständig wieder aufzuhängen, um sicherzustellen, dass die Beutezelle auf einzelzeller Ebene getrennt ist.
Um die Zellen auf die Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, mischen Sie zunächst 200 Milligramm niedrigfluoreszierende molekulare Agarose mit 20 Milliliter Calcium-Hippies Puffer und lösen Sie die Agarose in einer Mikrowelle auf. Gießen Sie drei Milliliter der geschmolzenen Agarose in eine 35-Millimeter-Glasbodenschale und lassen Sie die Agarose erstarren. Mit einem Labor-Mikrospachtel, vorsichtig entfernen Sie das Agarose-Pad aus der Schale, ohne den Mittelpol des Pads zu stören und legen Sie das Pad unten auf einer Petrischale Abdeckung.
Legen Sie fünf Mikroliter der konzentrierten Wirtszellsuspension auf das gekippte Pad und verwenden Sie eine Impfschleife, um Zellen im Mittelpol zu verteilen. Als nächstes fünf Mikroliter der konzentrierten B.bacteriovorus Suspension auf die wirtzellbeschichtete Oberfläche geben, ohne sich auszubreiten, und das Gel schnell auf die 35 Milliliter Glasbodenschale oben nach unten zurückgeben. Dann die Schale mit einem Deckel bedecken.
Für die Zeit-Lapse Florescence Mikroskopie der Co-Kultur, legen Sie die Schale in einem Petri Schale Halter, so dass die Schale nicht im Laufe des Experiments bewegen und legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das invertierte Mikroskop Objektiv und einen Tropfen auf dem Boden der Schale. Montieren Sie den Halter auf die Mikroskopstufe innerhalb der invertierten Mikroskopkammer und stellen Sie in der Mikroskopsoftware die Vergrößerung auf 100X und die Polychromlinse auf GFP und Mcherry ein. Suchen Sie mit einem iPS in Brightfield die Fokusebene, und öffnen Sie den sinnlosen Manager.
Bewegen Sie die Bühne, und verwenden Sie die Schaltfläche Markierungspunkte, um die Koordinaten von mindestens 10 Sehenswürdigkeiten zu speichern. Schalten Sie das Kameraval vom iPS auf den Monitor. Legen Sie die Fokusebene fest, und klicken Sie auf die Schaltfläche Punkt ersetzen im Punkt ohne Zu-Manager, um jeden Punkt zu kalibrieren.
Öffnen Sie den Experimentdesigner, und entmarkieren Sie die Stapelbox für Krankheiten. Wählen Sie die entsprechenden Fluoreszenzkanäle und die optimalen Eliminationseinstellungen aus und legen Sie die Intervalle zwischen der Bildaufnahme und der Gesamtzeit des Experiments fest. Aktivieren Sie die Fokuspflege für die ausgewählten Positionen, und wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.
Überprüfen Sie alle Einstellungen in der Steuerung der Mikroskopsoftware und starten Sie das Zeitrafferexperiment. Überprüfen Sie nach der ersten Stunde des Experiments, ob alle Bühnenpositionen noch im Fokus stehen. Wenn das Zeitrafferexperiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Petrischale und entsorgen Sie die 35-Millimeter-Schale mit einem Agarose-Pad nach den entsprechenden Biosicherheitsprotokollen.
Für die Verarbeitung der Zeitraffer-Bilddaten, übertragen Sie die experimentellen Daten auf einen Computer mit der Fidschi-Software geladen und öffnen Sie ein Bild in Fidschi. Wählen Sie in Importoptionen für Bioformate den Ansichtsstapel mit Hyperstack aus. Wählen Sie im zusammengesetzten Farbmodus die automatische Skalierung aus.
Durch scrollen Sie durch die Bildstapel beurteilen, ob die Zellen und Bdelloplaste im Laufe des Experiments im Fokus blieben. Ob die grünen Fluoreszenzflecken aus der DNA und mNeongrün innerhalb der B.bacteriovorus-Zellen innerhalb der Bdelloplasten während der Wachstumsphase vorhanden sind und ob alle Stadien des Raublebenszyklus visualisiert werden können. Um eine bestimmte B.bacteriovorus Zelle Bdelloplast zu analysieren, verwenden Sie ein Auswahlwerkzeug, um die Zelle von Interesse zu markieren.
Duplizieren Sie dann die ausgewählte Region. Klicken Sie im duplizierten Bild auf Prozess und glatt, und klicken Sie für jeden Fluoreszenzkanal auf Bild, Farbe, Kanäle, und wählen Sie den kanal von Interesse aus. Klicken Sie dann auf Bild, Anpassen und Helligkeitskontrast, um die Helligkeit und den Kontrast des Bildes in jedem Kanal anzupassen.
Um eine Maßstabsleiste hinzuzufügen, wählen Sie Analysieren, Werkzeuge und Maßstabsleisten aus. Um den Bildern einen Zeitstempel hinzuzufügen, klicken Sie auf Bilder, Stapel und Zeitstempel. Um die geänderten Bilder zu speichern, wählen Sie TIF aus.
Um die Daten als Bildsequenz zu speichern, AVI, um einen Film zu erstellen, oder PNG, um ein einzelnes Bild des aktuellen Frames zu speichern. Dieses auf Zeitraffer fluoreszenzbasierte System ermöglicht die Echtzeitverfolgung einzelner B.bacteriovorus Zellen und liefert wertvolle Informationen über jede Phase des komplexen Raublebenszyklus. Die pillenige mCherry-Fusion ermöglicht es, die gesamte Raubzelle sowohl in der Angriffsphase als auch in der frühen Phase der Wachstumsphase zu kennzeichnen.
Der Übergang vom Angriff in die replikierende Phase kann nicht nur durch die Host-Bdelloplast-Formation, sondern auch durch das Auftreten des Replisomen visualisiert werden. Das Replisome wird am eindringenden Zellpol montiert und mehr als ein Replisome kann innerhalb eines wachsenden B.bacteriovorus Filaments beobachtet werden, während die Reproduktionsphase fortschreitet. Nachdem mehrere Kopien des Chromosoms synthetisiert wurden, wird die Replikation beendet.
Schließlich wird das mehrkernige Filament septiert und die Vorläuferzellen aus dem Bdelloplast freigesetzt. Die B.bacteriovorus Zellen sollten material genug sein, um aktiv nach ihrer Beute zu suchen, und die gesamte Zelldichte sollte hoch genug sein, um eine räuberische Zellanhaftung zu ermöglichen. Diese Plattform kann in Experimenten mit multiresistenten Krankheitserregern nützlich sein und Verbesserungen in der Gentechnik des B.bacteriovorus als lebendes Antibiotikum in der Human- und Veterinärmedizin erleichtern.
