Der Flypub-Assay misst hemmungsloses Verhalten unter Alkoholeinfluss. Dadurch wird die mechanistische Untersuchung der Alkoholkonsumstörung erleichtert. Alkohol ist eine der am leichtesten erhältlichen und am häufigsten missbrauchten Drogen der Welt.
Der neurobiologische Mechanismus, der einer Alkoholnutzungsstörung zugrunde liegt, ist jedoch unvollständig verstanden. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wurde ausgiebig verwendet, um die Auswirkungen von Ethanol auf Euphorie, Fortbewegung, Hemmung und Sedierung zu untersuchen. Es wird auch verwendet, um seine langen und dauerhaften Veränderungen im Verhalten relevant für Sucht wie Toleranz zu studieren, Sensibilisierung, und Ethanol-Suche.
Viele Studien in Drosophila und anderen Tiermodellen konzentrieren sich auf die motorisamotorische Aktivierungswirkung von Ethanol. Die deutliche Wirkung von Ethanol ist die Verhaltenshemmung. Allerdings ist seine Studie eher unterrepräsentiert.
Um dieses Schlüsselproblem anzugehen, haben wir den Flypub-Assay entwickelt, um hemmungsloses Verhalten unter dem Einfluss von Ethanol zu messen. Um die Flypub-Kammer zu montieren, nehmen Sie eine runde Flasche und schneiden Sie den unteren Teil einer 25-Milliliter-Marke mit einer Rasierklinge ab. Erstellen Sie ein Loch an der 50-Milliliter-Marke mit einem heißen Lötkolben.
Dies ist der Zugangspunkt, an dem Fliegen eingeführt werden. Legen Sie ein rundes Netz mit einem Durchmesser von 54 Millimetern auf die 75-Milliliter-Marke und sichern Sie es mit Heißkleber. Positionieren Sie eine klare Kunststofffolie mit einem Durchmesser von 70 Millimetern am offenen Ende und sichern Sie sie mit Heißkleber.
Um sicherzustellen, dass die Kunststoffrunde fest am Boden befestigt ist, Drücken Sie mit Gewichten nach unten. Sammeln Sie männliche Fliegen in einer Gruppe von 33. Legen Sie sie auf die Seite einer Lebensmittel-Durchstechflasche.
Platzieren Sie sie in einem 25 Grad Celsius Inkubator mit mindestens 50% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stündigen Licht, 12 Stunden dunklem Zyklus für 2 Tage vor der Ethanol-Exposition. Bereiten Sie die Flypub-Assay-Station vor, indem Sie Lichter, einen Computer und eine Kamera für Videoaufnahmen einschalten. Bereiten Sie sechs Kneipen für eine Reihe von Experimenten vor.
Beschriften Sie sie mit den Nummern eins bis sechs. Bringen Sie die Fliegen vorsichtig mit einem kleinen Trichter in die Kneipe. Schließen Sie die Kneipe mit einem Band.
Akklimatisieren Sie die Fliegen für 10 Minuten. Passen Sie während der Akklimatisierung den Kamerafokus an und zeichnen Sie die letzten fünf Minuten der Akklimatisierung auf. Während der Akklimatisierung bereiten Baumwollpads für die Ethanol-Lieferung.
Schneiden Sie ein Wattepad in vier gleiche Quadranten und trimmen Sie dann die Ecken, damit es in eine Petrischale passt. Fügen Sie ein Wattepad zu einer Petrischale hinzu. Fügen Sie dem Wattestäbchen einen Milliliter 95% Ethanol hinzu.
Achten Sie darauf, dass die Ethanollösung gleichmäßig auf den gesamten Bereich des Pads verteilt wird. Bedecken Sie die Petrischale schnell mit Labortüchern. Legen Sie vorsichtig eine Ethanol-haltige Petrischale unter jede Kneipe.
Richten Sie die Kneipen auf der Bühne aus. Beginnen Sie mit der Aufnahme und starten Sie gleichzeitig einen Timer. Zeichnen Sie auf, bis fliegen aufhören zu hofieren oder sich zu bewegen.
Entfernen Sie das Ethanol enthaltende Petrischale, wenn über 90% der Fliegen sediert sind. Übertragen Sie die sedierten Fliegen vorsichtig zurück in Lebensmittelfläschchen. Legen Sie sie wieder in den Inkubator.
Wiederholen Sie die vorherigen Schritte alle 24 Stunden an sechs aufeinanderfolgenden Tagen. Öffnen Sie das Video mit einem Mediaplayer. Dann punkten Sie die Anzahl der Männer in Balz Aktivitäten alle 10 Sekunden beschäftigt.
Zu den zu punktenden Maßnahmen gehören: einseitige Flügelverlängerung, Balzkette, Balzkreis, Bauchbeugung und Montage. Gezeigt werden repräsentative Aufzeichnungen des Flugverhaltens. Während der Akklimatisierung, wo Männchen zeigen nicht viel Aktivität.
Bei der ersten Exposition, bei der Männchen sporadische Balz aufweisen. Und während der sechsten Exposition, wo Männchen zeigen Aktivität Balz. Geben Sie die Anzahl der Männer, die Balz anzeigen, in einem zehnsekunden-Zeitblock ein.
Verwenden Sie die maximale Anzahl von courting Männchen in drei aufeinander folgenden 10 Sekunden Zeitblöcke als repräsentativen Datenpunkt. Der Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Datenpunkten mit dem höchsten Wert stellt den prozentualen Anteil der zwischenmenschlichen Höflichkeit pro Kneipe dar. Der wilde Typ Canton-S zeigt nach und nach verstärkte Aktivitäten der hemmungslosen Balz bei wiederholter Ethanol-Exposition.
Dies stellt eine Verhaltenssensibilisierung für die Hemmungswirkung von Ethanol dar. Wir untersuchten die Rolle von Octopamin bei der Sensibilisierung, indem wir die Fliegen testeten, denen Tyramin-Beta-Hydroxylase, T beta H, fehlen, also einen Mangel an Oktopamin. Wie Canton-S zeigten die T beta H-Mutationen eskalierte Reaktionen auf wiederholte Ethanol-Exposition, jedoch auf einem reduzierten Niveau.
Wenn wir T beta H und Canton-S verglichen, stellten wir fest, dass die T beta H mutierten Männchen weniger hemmungslose Balz zeigten als Canton-S-Männchen in jeder Exposition, was darauf hindeutet, dass Octopamin für die Sensibilisierung wichtig sein kann. Jetzt können Sie Verhaltensweisen, die durch Ethanol induziert werden, mit dem Flypub-Assay einrichten, dirigieren und analysieren. Zu den wichtigsten Punkten, die sie beachten sollten, gehören eine ordnungsgemäße Montage der Kneipe.
Zwei, konsistente Ethanol-Lieferung und drei, präzise und unvoreingenommene Verhaltens-Score. Der Flypub Assay hat viele Vorteile. Es ist einfach, kostengünstig einzurichten und leicht zu erlernen.
Auch können mehrere Gruppen von Fliegen gleichzeitig untersucht werden, was diese Studie erleichtert, um die Auswirkungen genetischer oder experimenteller Manipulationen zu identifizieren. Der Flypub-Assay ist für Experimentatoren auf allen Ebenen hoch anziehend, einschließlich Grundschülern, Studenten und Absolventen, Post-Docs und Dozenten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Flypub-Assay es Ihnen ermöglicht, molekulare Akteure, zelluläre Bahnen, Gehirnkreise und Risikofaktoren zu identifizieren, die zur Alkoholkonsumstörung beitragen.
