Die molekulardynamische Simulation ist eine Computertechnik, die zur Erforschung molekularer Bewegungen eingesetzt werden kann und konforme Veränderungen aufzeigen kann, die für das Verständnis der biochemischen und zellulären Funktion entscheidend sind. Es ist schwierig, den Bereich dynamischer Bewegungen zu untersuchen, die für ein Makromolekül zugänglich sind. Die Verwendung der Ergebnisse molekulardynamischer Simulationen in Verbindung mit experimentellen Daten ermöglicht eine Bewertung ihrer funktionellen Signifikanz.
Anhand molekulardynamischer Simulationen zeigen wir, wie sich bei Krebspatienten beobachtete Mutationen auf EGFR-Targeting-Bestätigungen und Ligandenbindung auswirken. Um den Wildtyp apo active EGFR unserer Kinasestruktur vorzubereiten, öffnen Sie das Kymera-Visualisierungsprogramm, und klicken Sie im Dateimenü auf nach ID.Wählen Sie die Protein Data Bank-Datenbank und geben Sie den Protein Data Bank 2GS2-Code an. Um die fehlenden strukturellen 2GS2-Elemente zu bauen, erwerben Sie diese Segmente aus anderen EGFR-Strukturen.
Um die fünf Rückstände Glutamat 746 zu Alanin 750 ELREA Deletion in EGFR zu konstruieren, klicken Sie auf Favoriten, Sequenz, und zeigen Sequenz, um die Wild-Typ 2GS2 Sequenz zu öffnen. Und klicken Sie im resultierenden Sequenzfenster auf Bearbeiten und Fügen Sie die Sequenz hinzu, um die FastA-Formatsequenz für die Löschmutation auszuwählen. Wählen Sie im Ausrichtungsfenster die Struktur und das Modell oder die Homologie aus.
Geben Sie im Popupfenster die 2GS2-Verbundstruktur als Vorlage und die Mutantensequenz als zu modellierende Abfrage an, und wählen Sie dann ein Mutantenmodell aus den resultierenden Modellen basierend auf der zDOPE-Bewertung und der visuellen Inspektion aus. Um die wildtypainaktive EGFR-Kinasestruktur vorzubereiten, öffnen Sie die Protein Data Bank Struktur 2GS7 und fügen Sie die fehlenden Segmente aus den anderen EGFR-Strukturen hinzu, wodurch die Löschmutationsform wie gezeigt modelliert wird. Um die ATP-gebundene aktive EGFR-Kinasestruktur am TYP ATP vorzubereiten, verwenden Sie die Protein Data Bank Struktur 2ITX als Hauptstruktur, indem Sie die fehlenden Segmente mit anderen EGFR-Strukturen erstellen und die Löschmutationsform mithilfe des Modellierers modellieren, wie gezeigt.
Um die wild-Typ EGFR asymmetrische Dimerstruktur zu konstruieren, öffnen Sie 2GS2 in Kymera und klicken Sie auf Werkzeuge, Struktur höherer Ordnung und Einheitszelle, um die Struktur in die biologische Baugruppe zu konvertieren, die den Aktivator und Empfängerkiinasen in der asymmetrischen Anordnung enthält. Wählen Sie die 2GS2-Struktur aus, und geben Sie Kopien anfertigen, und speichern Sie dann einen einzelnen asymmetrischen Dimer aus den mehreren Kopien des Dimers, die sich aus den Symmetrievorgängen ergeben. Um die Alanin-Mutation 702 zu erstellen, wählen Sie Werkzeuge, Strukturbearbeitung und Rotamer aus, um Alanin 702 durch Valin zu ersetzen.
Öffnen Sie die Strukturen in Maestro und klicken Sie auf die Schaltfläche "Proteinvorbereitungsassistent", wählen Sie Wasserstoffatome hinzufügen und fehlende Seitenkettenatome ausfüllen und auf den Vorprozess klicken. Um die Protonationszustände von ionisierbaren Rückständen bei pH 7,0 zu bestimmen, klicken Sie auf Verfeinern und verwenden Sie PROPKA, um die Ausrichtung von Asparagin-, Glutamin- und Histaminrückständen für die Wasserstoffbindung zu optimieren, und minimieren Sie dann die Struktur. Um das Simulationssystem einzurichten, öffnen Sie das LEAP-Programm und importieren Sie das Kraftfeld Bernstein FF14SB und die TIP3P-Wassermoleküle.
Importieren Sie für die ATP-gebundenen Systeme Parameter für ATP und laden Sie die Struktur. Solvate die Struktur in einer Oktaeder-Box mit expliziten TIP3P-Wassermolekülen, die 10 Angstroms in alle Richtungen von den Oberflächenatomen des Proteins erstreckt. Überprüfen Sie das Gurtsystem und fügen Sie die notwendigen Ionen hinzu, um es zu neutralisieren.
Um biomolekulare Systeme ausreichend zu modellieren, fügen Sie zusätzliche Natrium- und Chloridatome in die Simulationsbox ein, um die Salzkonzentration des Systems auf 0,15 Mol zu bringen, und speichern Sie dann die Topologie und Koordinatendateien des Systems, um als Input für die nachfolgende Produktionssimulation zu dienen. Mit Amber minimieren anfängliche Energie das Simulationssystem, um ungünstige Konfigurationen zu umgehen. Passen Sie in der Minimierungseingabedatei die maximale Zyklusvariable für den gesamten Minimierungszyklus und die Anzahl der Zyklen an, um die Anzahl der Zyklen für den steilsten Abstiegsalgorithmus anzugeben.
Verwenden Sie die Rückhaltegewichtsvariable, um die durch den Parameter rückhaltemaske angegebene Rückhaltekraft auf die gelösten Atome anzuwenden. Führen Sie die Minimierung in mehreren Schritten durch, und senken Sie schrittweise die Auflagen, die auf die gelösten Atome angewendet werden, von 25 auf 0 Kilokalorien pro Mole-Angstrom-Quadrat, und verwenden Sie dann den Befehl, um die Minimierung auszuführen. Erhitzen Sie das System für 100 Pikosekunden von 0 bis 300 Kelvin und verwenden Sie die Befehle, um eine 10-Kilo-Kalorien-Molar pro Quadrat-Angstrom-Rückhaltesystem auf gelöste Atome einzustellen.
Verwenden Sie dann den Befehl, um die Heizung durchzuführen. Gleichgewichten Sie das System für 900 Pikosekunden unter einem isothermen isobarischen Ensemble und setzen Sie einen neun angstrom Entfernungsabstand für elektrostatische Wechselwirkungen mit großer Reichweite, senken Sie allmählich die solute Atom-Beschränkung auf 0,1 Kilokalorien pro Mole-Angstrom-Quadrat und finalisieren das Gleichgewicht mit einer hemmungslosen Fünf-Nanosekunden-Simulation. Führen Sie den Ausgleich mit dem angegebenen Befehl aus.
Passen Sie den Text so an, dass die Produktionssimulation 100 Nanosekunden lang durchgeführt werden kann, wobei die Konatationen alle 10 Pikosekunden gespeichert werden, und führen Sie die Simulation dann wie angegeben mit dem Befehl aus. Um die Konformationsprobe während der Wildtyp- und mutierten EGFR-Kinase-Simulationen zu visualisieren, öffnen Sie die Bernstein-Topologiedateien und die entsprechenden Trajektoriendateien in Visual Molecular Dynamics. Und mit hilfe bequemer sekundärer Strukturdarstellungen, analysieren Sie die gesamte strukturelle Dynamik der Proteine aus der aufgezeichneten Flugbahn.
Betrachten Sie dann spezifische Wechselwirkungen zwischen Atomen und Rückständen von Interesse, wie die katalytisch essentielle Lysin 745-Glutamat 762 Salzbrücke. Alternativ können Sie mehrere Konformationen speichern, die während der Simulation im Protein Data Bank-Format abgetastet wurden, und öffnen Sie die Konformationen in Kymera. Verwenden Sie die Matchmaker-Option, um die Strukturen auf der Anfangs- oder Medianstruktur zu überlagern und die Medianstruktur in Volumenkörper und den Rest der ausgerichteten Strukturen in verblasstem Weiß anzuzeigen, um eine Visualisierung der aufgezeichneten Strukturbewegungen mit mehr Klarheit zu ermöglichen.
Um die globale Stabilität der wildtypigen und mutierten EGFRs zu analysieren und die Flexibilität der verschiedenen Struktureinheiten zu untersuchen, importieren Sie die Bernsteintypologie und die entsprechenden Flugbahndateien. Geben Sie in der Eingabedatei für die mittlere Quadratabweichung summieren Sie die Backbone-Atome der Anfangsstruktur als Referenz für die wurzelmittelgroße quadratische Anpassung an. Geben Sie in der Eingabedatei für die mittlere quadratische Schwankungsbasis der Wurzel die C-Alpha-Atome der Anfangsstruktur als Referenz für die wurzelmittelförmige quadratische Anpassung an.
Führen Sie dann die Analyse mit dem CPPTRAJ-Programm aus und zeichnen Sie die Ausgabedaten auf. Alternativ können Sie die konformen Ensembles ausrichten und jeden Rückstand basierend auf der mittleren quadratischen Abweichung der C-alpha-Atomwurzel färben, die Konformationen in Kymera öffnen und an der Matchmaker-Option ausrichten. Wählen Sie Werkzeuge, Darstellung und Rendern nach Attribut aus.
Wählen Sie Rückstände der konformen Ensembles aus, und legen Sie die mittlere quadratische Abweichung der C-Alpha-Wurzel als Attribute fest, und klicken Sie dann auf OK. Die Kettenspur der Konformationen wird blau, weiß oder rot gefärbt, was die Bereiche mit hoher, mittlerer und niedriger struktureller Stabilität widerspiegelt. Um die Wasserstoffbindungswechselwirkungen zwischen ATP und Wildtyp- und Lösch-EGFRs zu analysieren, bereiten Sie ein CPPTRAJ-Skript vor, um diese Aufgabe auszuführen. Geben Sie die Analyse für die intermolekularen Wasserstoffbindungen nur mit der Nointramol-Variablen an und definieren Sie eine Wasserstoffbindung mit einem Spender-Akzeptor-Abstand von weniger als oder gleich 3,5 Angstroms und einem Bindungswinkel von mehr als oder gleich 135 Grad.
Um beispielsweise die intramolekularen Wechselwirkungen zwischen den katalytisch wichtigen Lysin- und Glutamatrückständen zu bewerten, geben Sie Lysin als Wasserstoffspender und Glutamat als Akzeptorrückstände an und führen sie das Skript wie angegeben aus, um eine Analyse des Ergebnisses zu ermöglichen. Um die bindungsfreien Energien zwischen ATP und sowohl Wildtyp- als auch Lösch-EGFRs zu berechnen, bereiten Sie die Gasphasen-Ligand-Rezeptor- und Ligandenrezeptor-komplexen Protein Data Bank-Dateien im LEAP-Programm vor und setzen ATP als Liganden und EGFR als Rezeptor. Legen Sie den generalisierten Radiowert auf M Bond I2 fest. Generieren Sie dann die Bernstein-Topologie und koordinieren Sie Dateien für die Gasphase Protein Data Bank-Dateien.
Ebenso geben Sie zur Berechnung der bindungsfreien Energien zwischen den Aktivator- und Empfängerkinasen von Wildtyp und Alanin 702-Valine-EGFRs die Empfängerkinase als Liganden und die Aktivatorkinase als Rezeptor an und speichern die entsprechenden Topologie- und Koordinatendateien. Bereiten Sie eine molekularmechanik generalisierte Born-Oberflächen-Eingabedatei vor, und legen Sie den IGB-Wert auf zwei und den Saltcon auf 0,1 fest. Dann mit dem mmpbsa.
py Skript verfügbar in Amber, geben Sie den Befehl wie angegeben, um die Bindung Energieberechnungen auszuführen und die Ausgabedaten zu analysieren. Während dieser repräsentativen 100-Nanosekunden-Simulation zeigte der Alanin 702-Valine-Mutant eine erhöhte Konformationsstabilität des Adxtamembran-B-Segments, die wahrscheinlich auf engere hydrophobe Wechselwirkungen im Vergleich zum Wildtyp EGFR zurückzuführen ist. Der Alanin 702 Valine-Mutant zeigte auch eine geringere freie Bindungsenergie zwischen Aktivator und Empfängerkinasen im Vergleich zum Wildtyp EGFR, was günstigere Dimer-Wechselwirkungen darstellt, die die aktive EGFR-Kinase-Konformation beibehalten.
Die Simulation der Deletionsmutation führte zu niedrigeren C-Alpha-Atomschwankungen der funktional schlüsselgreifenden Alpha-C-Helix im Vergleich zum Wildtyp EGFR, wodurch die Zeit des EGFR-Aktivzustands verlängert wurde. Die Deletionsmutation führte auch zu einer häufigen Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen den Seitenkettenpolaratomen von Lysin 745 und Glutamat 762, einer Schlüsselinteraktion für die emenzymatische Aktivität von EGFR im Vergleich zu Wildtyp-EGFR. Darüber hinaus war die Anzahl der Wasserstoffbindungen zwischen ATP und EGFR für die Löschmutation größer als für den Wildtyp EGFR.
Die Deletionsmutation führte auch zu einer inneren Bewegung des inaktiven EGFR-Zustands alpha C-Helix, einer strukturellen Veränderung, die während des Übergangs zum aktiven Zustand erwartet wird. Im Gegensatz dazu behielt die Alpha-C-Helix des inaktiven Wildtyps EGFR ihre anfängliche Konformation bei. Um die Auswirkungen der Mutationen zu bewerten, ist es wichtig, die geeigneten Konformationszustände der Strukturen auszuwählen und diese Strukturen richtig vorzubereiten und auszubessern.
Es ist wichtig, molekulardynamische Simulationen mit experimentellen Studien zu kombinieren, da die Synergie zwischen diesen Techniken der Interpretation der Ergebnisse zugute kommt und zusätzliche Nasslaborexperimente informieren kann.
