Die Autoren möchten anerkennen, dass diese Forschung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union für das PATROLS-Projekt im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 760813 gefördert wurde.

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	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Anwendungen für 3D-Lebermodelle variieren erheblich, je nachdem, auf den jeweiligen biochemischen Endpunkt oder den unerwünschten Ergebnisweg gezielt. Jedes Modell hat seine Vorteile und Einschränkungen, von Interdonor Variation in primären menschlichen Hepatozyten (PHH) Modelle zu reduzierten Cytochrom p450 Aktivität in Zelllinien-basierten Modellen, aber alle sind wertvoll in ihrem eigenen Recht6,12,18,19. Bei der Bewertung der Genotoxizität gibt es Einschränkungen in den Modellen Kompatibilität mit gesetzlich zugelassenen Endpunkten wie der In-vitro-Mikrokern-Assay, da aktive Proliferation erforderlich ist. Dies ist notwendig, da die Genotoxizitätsbewertung erfordert, dass die Quantifizierung von festen DNA-Schäden nach der Zellteilung bewertet wird, wenn die Möglichkeit besteht, dass die DNA-Reparatur vorübergehende Läsionen korrigiert. Leider bilden hochdifferenzierte Hepatozyten (d.h. HepaRG) sphäroide oder PHH-Mikrotissues, die als die physiologisch relevantesten leberähnlichen Eigenschaften gelten, statische (nicht-proliferative) Modelle12,19,20. Daher bietet das hier vorgestellte 3D HepG2 Sphäroid-Modell ein geeignetes, alternatives Modell, das Genotoxizitätstests unterstützen kann. HepG2-Zelllinien-basierte Sphäroide haben genügend aktiv teilende Zellen auf der außenoberfläche der Sphäroide unter Beibehaltung grundlegender leberähnlicher Eigenschaften, wie Albumin- und Harnstoffproduktion und einige CYP450-Aktivität5,12,19. Hauptsächlich wurde dieses In-vitro-Lebermodell entwickelt, um den Mikrokern-Assay zu ergänzen, da dies einer der beiden In-vitro-Assays ist, die in der Batterie für Genotoxizitätstests8,10,11,21empfohlen werden. Das Modell kann jedoch problemlos auf DNA-Sequenzierungsanalysen und Genexpressionstechnologien (RNA) angewendet werden, während es das Potenzial hat, weiter angepasst und für andere DNA-Schadensendpunkte wie den Kometentest genutzt zu werden. Nichtsdestotrotz ist es wichtig, die Rolle zu berücksichtigen, die ENM-Interferenzen bei einigen Endpunktanalysen spielen. Beispielsweise sind Strömungszytometrie-basierte Analysen möglicherweise nicht für die ENM-Genotoxizitätsbewertung geeignet, insbesondere aufgrund von Partikelstörungen22.
Ein begrenzender Faktor von Sphäroidmodellen, die sich aktiv einer Zellteilung unterziehen, ist ihre Größe. Die Optimierung der Saatdichte ist von entscheidender Bedeutung, da genügend Zellen vorhanden sein müssen, die es dem Modell ermöglichen, sich weiter auszumehren. aber nicht zu hoch eine Zellzahl, was dazu führt, dass das Sphäroid übermäßig kompakt wird, was zu einem erhöhten nekrotischen Kern führt. Die Ursache dieser Nekrose wird geglaubt, um eingeschränktsauerstoff- und Nährstoffdiffusion sein, da die Grenze dieser Diffusion wird angenommen, dass etwa 100 – 150 m Gewebe23,24. Dies hängt jedoch vom Zelltyp, der Zellnummer, den Gerüstinteraktionen und den Kulturbedingungen25ab. Seitdem hat sich gezeigt, dass etwa 700 m Durchmesser die Grenze zur Vermeidung eines vorzeitigen Beginns der Nekrose in der Mitte von C3A-Sphäroiden ist, die Aussaat von 4000 HepG2-Zellen pro Sphäroid stellt sicher, dass der Durchmesser des Modells zum Zeitpunkt der Exposition ≤500 m26beträgt. Darüber hinaus stellten Shah et al. fest, dass HepG2-Zellen mit einem Samen von mehr als 5000 Zellen pro Sphäroid nach 7 Tagen in der Kultur eine 25%ige Verringerung der Lebensfähigkeit aufwiesen, was sich auf den durchschnittlichen Durchmesser von 680 m und die begrenzte Verfügbarkeit von Nährstoffen in einem 20-L-Hängetropfen5beziehen konnte. Um dies zu überwinden, durchläuft das im vorliegenden Protokoll entwickelte Modell einen kritischen Schritt, bei dem der hängende Tropfen nach der Erstbildung des Sphäroids in Agarose-beschichtete Brunnen übertragen wird. Dies stellt sicher, dass ein größeres Volumen an Kulturmedium vorhanden ist, um die ständig wachsende Anzahl von Zellen innerhalb der Sphäroide zu erhalten. Infolgedessen bleibt das HepG2 Sphäroid-Modell nach 10 Tagen in der Kultur über 70% lebensfähig und kann für die langfristige Gefährdungsbeurteilung in vitro genutztwerden. 
Während das HepG2 Sphäroid-Modell sowohl akute als auch langfristige Expositionsregime unterstützen kann, ist die Erfrischung des Zellkulturmediums während längerer Kulturperioden für dieses Modell eingeschränkt, da ein vollständiger Ersatz des Mediums aufgrund des potenziellen Verlusts der Sphäroide nicht empfohlen wird. Es wird vermutet, dass bei ENM-Expositionen die Tendenz zu homogenen ENM-Dispersionen zu Agglomerat und Sediment hoch ist. Es ist jedoch bemerkenswert, dass die Rate, mit der ein ENM-Sediment je nach Denplyse parametern (z. B. Größe, Form und Dichte) variieren kann und theoretisch anhand des In-vitro-Sedimentations-, Diffusions- und Dosimetriemodells (ISDD) oder seiner jüngsten Derivate bestimmt werden kann, auf die bei ENM-Expositionsansätzen oft Bezug genommen wird27,28. Dabei wird angenommen, dass, wenn nur 50% des Zellkulturmediums vorsichtig von der Oberfläche der Zellkultur entfernt werden, die Störung und anschließende Entfernung der ENM-Dosis theoretisch minimal sein sollte. Mit Brownian Bewegung im Spiel, kann dies jedoch nicht unbedingt der Fall sein und weitere Arbeiten in der Ablagerung und Sedimentation jedes einzelnen ENM getestet werden sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die richtige Dosimetrie während der langfristigen Expositionsregime beibehalten wird27. Grundsätzlich ist dies eine potenzielle Einschränkung, die bei der Durchführung wiederholter Dosiersysteme zu berücksichtigen ist, da dies für die endgültige, akkumulierte Konzentration von entscheidender Bedeutung sein könnte. Chemische Expositionen hingegen bieten, auch wenn sie nicht ohne ihre eigenen Einschränkungen zu berücksichtigen sind, einen vereinfachteren Ansatz, da chemische Stoffe tendenziell in Lösung bleiben und somit ein direkter Ersatz der ursprünglichen chemischen Konzentration zusätzlich zur neu zugesetzten Konzentration dafür sorgt, dass alle Chemikalien, die während der Medienerfrischung verloren gehen, entsprechend ersetzt werden29. Zukünftige Anwendungen würden die Bewertung der Eignung des Modells für wiederholte Expositionsregime über langfristige Kulturperioden umfassen, da wiederholte Dosierstrategien von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung der Fähigkeit eines bestimmten Organsystems sind, die durch die Bioakkumulation einer xenobiotischen Substanz verursachten nachteiligen Auswirkungen zu mildern oder zu überwinden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses 3D-In-vitro-Hepatikmodell in der Lage ist, eine Reihe realistischer Expositionsszenarien zu bewerten und damit einen zukünftigen In-vitro-Ansatz bereitzustellen, um sowohl enM als auch die Bewertung chemischer Gefahren routinemäßig und leicht zugänglich zu unterstützen.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Aufgrund der raschen Entwicklung und Umsetzung einer Vielzahl von technischen Nanomaterialien (ENM) in einer Vielzahl von anwendungen auf menschlicher Basis (z. B. Lebensmittel, Kosmetik, Bekleidung, Sportausrüstung, Elektronik, Transport und Medizin) ist es unvermeidlich, dass der Mensch regelmäßig ENM ausgesetzt wird. Damit wächst die Sorge, dass die neuartigen, größenspezifischen physiochemischen Eigenschaften, die diese Materialien in zahlreichen Anwendungen für vorteilhaft erachten, gleichzeitig negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und die Umwelt haben könnten. Derzeit gibt es viele internationale Aktivitäten, um physiologisch relevantere Expositionen gegenüber diesen ENM aktiv widerzuspiegeln und die potenzielle Toxizität dieser Materialien über akute, langfristige und wiederholte Szenarien mit niedriger Dosis exposition zu bewerten.
Hepatische Toxikologie ist der Schlüssel bei der Betrachtung der ENM-Exposition, da allgemein bekannt ist, dass die Leber ein wichtiger Ort der ENM-Akkumulation nach der Exposition1,2ist. Darüber hinaus ist die Leber das primäre Organsystem für den Stoffwechsel und die Entgiftung von Substanzen, die in den systemischen Kreislauf gelangen3. Basierend auf dem akzeptierten Verständnis, dass 2D-Hepatozytenmodelle die Komplexität komplizierter multizellulärer Wechselwirkungen nicht genau imitieren oder die in vivo beobachtete metabolische Aktivität angemessen darstellen, wurde ein größerer Fokus auf die Entwicklung robuster und physiologisch relevanter In-vitro-3D-Lebermodelle für In-vivo-Ersatztechnologien festgelegt4,5. Der Einsatz fortschrittlicher 3D-Kulturtechnologien verbessert die Langlebigkeit von In-vitro-Lebermodellen, so dass langfristige, wiederholte Expositionsregime untersucht werden können. Darüber hinaus fördert dieses fortschrittliche Kulturformat die Bildung verbesserter physiologischer, organotypischer Merkmale wie Gallenkanaliculi, aktive Transporterprozesse und verbesserte CYP450-Wirkstoffmetabolisierungsfähigkeiten, wodurch die Prädiktodibilität der Modelle6verbessert wird. Aktuelle 3D-In-vitro-Hepatikmodelle, die aus Monokulturen (nur Hepatozyten) oder Kokulturen (Hepatozyten mit nichtparenchymalen Zellen) bestehen, existieren in mehreren Formaten, von Mikrotissues oder Sphäroiden in ultraniedrigen Haftplatten, hängenden Tropfensphäroiden, In Matrizen und/oder Gerüsten eingebetteten Zellen und mikrofluidischen Zellkulturplattformen, die alle als effektive fortgeschrittene In-vitro-Modelle für die Beurteilung der Lebertoxizität6,7gelten. Die meisten dieser Modellsysteme sind jedoch wartungsarm, erfordern spezielle Ausrüstung und sind teuer. Darüber hinaus sind diese Modelle häufig statisch (d. h. nicht dividierende Zellmodelle), die ihre Verwendung bei der Bewertung von Gefahrenendpunkten verhindern, wie z. B. Genotoxizitätstests mit Methoden, die feste DNA-Schäden quantifizieren. Genotoxizität ist eine wesentliche Voraussetzung in der regulatorischen Toxikologie, und es ist ein wichtiger Bestandteil der Risikobewertung von giftem Mittel8. Es gibt keinen einzigen Test, der angewendet werden kann, um alle Formen von DNA-Schäden zu quantifizieren, die nach der Exposition gegenüber einem exogenen Mittel auftreten können. Ein Kernbestandteil der In-vitro-Genotoxizitätstestbatterie ist jedoch der Mikrokern-Assay, eine zuverlässige und facettenreiche Technik, die grobe Chromosomenschäden misst9. Es handelt sich um eine Goldstandardtechnik, die von der OECD-Testleitlinie 487 zur Beurteilung von In-vitro-DNA-Schäden und Genotoxizität beschrieben wird, und ist Teil der Prüfbatterieanforderung für die regulatorische Risikobewertung10,11.
Die humane hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie, HepG2, wird häufig für das erste Risikobewertungsscreening verwendet, da die Zellen leicht verfügbar, relativ kostengünstig zu beschaffen, einfach zu kulturierbar und für ein Durchsatzscreening12,13zugänglich sind. Wenn sie in 3D-Sphärische Strukturen kultiviert werden, haben sie gezeigt, dass sie die Mikroumgebung der Leber gut rekapitulieren und ein Lebermodell mit ausreichenden proliferativen Fähigkeiten bieten, um den Mikrokern-Assay3zu unterstützen. Die Weiterentwicklung der HepG2-Sphäroidmodelle wurde etabliert, um die Langlebigkeit und Leber-ähnliche Funktionalität des Modells zu verbessern, um die Bewertung der Genotoxizitätsgefährdung über langfristige, wiederholte Expositionsregime (≤14 Tage) zu unterstützen. Daher wurde das vorliegende Protokoll gemäß den Grundsätzen der 3Rs, die Tierversuche ersetzen, reduzieren und verfeinern sollen, eingeführt, um ein fortschrittliches 3D-In-vitro-Hepatikmodell bereitzustellen, das in der Lage ist, mehrere toxikologische Endpunkte (z. B. Leberfunktionalität, (Pro-)Entzündungsmarker, Zytotoxizität und Genotoxizität) nach akuten, langfristigen und wiederholten chemischen und ENM-Expositionen routinemäßig und leicht zugänglich zuverlässig zu bewerten.
Hier stellen wir eine Methode zur Etablierung eines physiologisch relevanten 3D-Hepatozyten-Zelllinien-basierten In-vitro-Modellsystems zur Bewertung der Genotoxizitätsgefährdung nach akuten oder langfristigen, wiederholten ENM-Expositionen vor. Das Protokoll kann in 6 Schlüsselstufen unterteilt werden: Kultivierung kryokonservierter HepG2-Zellen; HepG2 Sphäroid Vorbereitung; HepG2 Sphäroid Transfer von hängenden Tropfen zu Agarose Suspension; HepG2 Sphäroid Ernte; Mikrokern-Assay und Scoring; datenanalyse.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Aufgrund der schnellen Entwicklung und Implementierung einer Vielzahl von technischen Nanomaterialien (ENM) ist eine Exposition gegenüber ENM unvermeidlich und die Entwicklung robuster, prädiktiver In-vitro-Testsysteme ist unerlässlich. Die Hepatische Toxikologie ist der Schlüssel bei der Betrachtung der ENM-Exposition, da die Leber eine wichtige Rolle bei der metabolischen Homöostase und Entgiftung spielt und ein wichtiger Ort der ENM-Akkumulation nach der Exposition ist. Basierend auf diesem und dem akzeptierten Verständnis, dass 2D-Hepatozytenmodelle die Komplexität komplizierter multizellulärer Wechselwirkungen und metabolischer Aktivität, die in vivo beobachtet werden, nicht genau imitieren, liegt ein größerer Fokus auf der Entwicklung physiologisch relevanter 3D-Lebermodelle, die auf ENM-Gefahrenbewertungszwecke in vitro zugeschnitten sind. In Übereinstimmung mit den Prinzipien der 3Rs, um Tierversuche zu ersetzen, zu reduzieren und zu verfeinern, wurde ein 3D HepG2 Zelllinien-basiertes Lebermodell entwickelt, das ein benutzerfreundliches, kostengünstiges System ist, das sowohl erweiterte als auch wiederholte ENM-Expositionsregime (≤14 Tage) unterstützen kann. Diese Sphäroidmodelle (≥500 m Durchmesser) behalten ihre proliferative Kapazität (d. h. Zellteilungsmodelle) und können so mit dem Mikrokernassay "Goldstandard" gekoppelt werden, um die Genotoxizität in vitro effektiv zu bewerten. Ihre Fähigkeit, über eine Reihe von toxikologischen Endpunkten zu berichten (z. B. Leberfunktion, (Pro-)Entzündungsreaktion, Zytotoxizität und Genotoxizität) wurde mit mehreren ENMs sowohl in akuten (24 h) als auch in langfristigen (120 h) Expositionsregimen charakterisiert. Dieses 3D-In-vitro-Hepatikmodell kann für die Bewertung realistischerer ENM-Expositionen genutzt werden und bietet damit einen zukünftigen In-vitro-Ansatz, um die ENM-Risikobewertung routinemäßig und leicht zugänglich zu unterstützen.

Die Eignung dieses zelllinienbasierten 3D-Lebersphäroidmodells für die Langzeitkultur und die genotoxische Gefährdungsbeurteilung wurde durch die Durchführung einer Basischarakterisierung bewertet, um die Lebensfähigkeit und Leber-ähnliche Funktionalität des Modells über die Dauer von 14 Tagen in der Kultur sowie seine Anwendbarkeit für den Mikrokern-Assay zu bestimmen.
Baseline Charakterisierung des 3D HepG2 Lebersphäroidmodells Vor jeder in vitro toxikologischen Bewertung ist es wichtig zu überprüfen, ob sich die 3D HepG2 Sphäroide richtig gebildet haben, bevor der Agarosetransfer oder die chemische/ENM-Behandlung durchgeführt wurde. HepG2-Sphäroide, die mit der Hängetropfenmethode hergestellt werden, brauchen in der Regel 2 - 3 Tage nach der Aussaat (4000 Zellen/Sphäroid), um kompakte, kugelförmige Sphäroide mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 495,52 w x 482,69 m H zu bilden, wie in Abbildung 5A-5Cdargestellt. HepG2-Sphäroide, die sich richtig gebildet haben und für die in vitro toxikologische Bewertung verwendet werden können, müssen eine kompakte, kugelförmige Struktur mit einer glatten Oberfläche und ohne visuelle Projektionen aufweisen. Abbildung 5 enthält Beispiele für gute Qualität (Abbildung 5D-F) und eine schlechte Qualität (Abbildung 5G-I) Sphäroide. Letzteres sollte verworfen werden. Typischerweise bilden sich 90-95% der pro Platte gebildeten Sphäroide richtig und sind für weitere Experimente lebensfähig.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Abbildung 5: Lichtmikroskopiebilder, die die natürliche Morphologie der HepG2-Sphäroide zeigen, die über die Hangtropfenmethode gebildetwerden. (A-C) zeigen Tag 2 und (D-I) Tag 4 HepG2 Lebersphäroide nach der Aussaat. (D-F) sind Beispiele für hochwertige HepG2-Sphäroide, während (G-I) schlecht geformte Sphäroide zeigt. Alle Bilder wurden auf einem X20-Objektiv mit einem Mikroskop aufgenommen. Die Maßstabsleiste steht für 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die Lebensfähigkeit des HepG2-Sphäroids weiter zu bestätigen, kann ein farblich-ähnlicher Bromocresol Green Albumin (BCG) Assay oder Harnstoff-Assay durchgeführt werden, um deren Leber-ähnliche Funktionalität zu bewerten. Die leberähnliche Funktionalität wurde anhand des Trypan Blue Exclusion Assay über einen Zeitraum von 14 Tagen im Einklang mit der Lebensfähigkeit bewertet, um die Langlebigkeit des Lebersphäroidmodells zu bestimmen und festzustellen, ob es eine langfristige oder wiederholte ENM/chemische Risikobewertung unterstützen könnte (Abbildung 6). Die Albumin-Konzentration blieb während der gesamten Kulturperiode konstant. Die Harnstoffproduktion zeigt eine Erhöhung der Harnstoffkonzentration, die pro Sphäroid über eine Woche in der Kultur produziert wird, bevor sie am Tag 7 ein Plateau erreicht. Es ist wichtig zu beachten, dass die in den 3D HepG2 Sphäroiden produzierten Gehalte an Albumin und Harnstoff wesentlich höher sind als die in derselben Zelllinie in einem 2D-Format kultivierten. Tatsächlich betrugen die 2D-Kulturen von HepG2-Zellen, Peak-Albumin- und Harnstoffspiegeln 0,001 mg/ml bzw. 0,010 ng/l. Darüber hinaus heben die Autoren in früheren Arbeiten, die von Shah et al. unter Verwendung eines nahezu identischen HepG2-Sphäroidsystems veröffentlicht wurden, eine bemerkenswerte Verbesserung der metabolischen Aktivität (CYP1A1 und CYP1A2) in den 3D HepG2 In-vitro-Modellsystemen im Vergleich zu den 2D-kultivierten HepG2-Zellen5hervor.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Abbildung 6: 14-Tage-Basischarakterisierungsdaten für HepG2-Lebersphäroide. Nach der Übertragung von hängendem Tropfen hebt (A) die Lebensfähigkeit des HepG2 Sphäroidmodells über einen Zeitraum von 14 Tagen hervor, während (B) und (C) die leberähnliche Albumin- bzw. Harnstofffunktionalität hervorheben. Mittelwertdaten ± SEM dargestellt, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Mit der unvermeidlichen Entwicklung eines nekrotischen Kerns, einer bekannten Einschränkung von 3D-Lebersphäroidkulturen, musste die Lebensfähigkeit dieses HepG2-basierten Modells hergestellt werden, um zu zeigen, dass es in der Lage war, langfristige (5-10 Tage) Expositionsregime aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die proliferative Fähigkeit aufrechtzuerhalten, die erforderlich ist, um den Mikrokern-Assay5zu unterstützen. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass dieses 3D-Lebersphäroid-Modell über 10 Tage in der Kultur >70% Lebensfähigkeit behält. Basierend auf dieser und in Verbindung mit der anhaltenden Leber-ähnlichen Funktionalität, die während der ≥14-Tage-Kulturperiode beobachtet wurde, kann dieses 3D-Lebersphäroid-Modell so langfristige, wiederholte ENM-Expositionsregime von bis zu 10 Tagen unterstützen (d. h. bevor die Lebensfähigkeit der Sphäroide unter 70 fällt). Als Referenz wird empfohlen, dass die Albuminspiegel für HepG2-Sphäroide, die mit 4000 Zellen/Sphäroid ausgesät sind, ≥20,0 ng/L betragen sollten, während die Harnstoffproduktion ≥0,25 ng/L betragen sollte, bevor eine in vitro toxikologische Bewertung mit diesem Modell durchgeführt wird.
Genotoxizitätsbewertung von technischen Nanomaterialien Für die Genotoxizitätsbewertung wurde der Mikrokerntest verwendet, um das Vorhandensein von Mikronuklei nach akuten (24 h) und langfristigen (120 h) ENM-Expositionen zu bestimmen. Aflatoxin B1 ist ein bekanntes Leberkarzinogen16,17 und ist eine empfohlene positive Kontrolle für den Mikrokern-Assay. Optimierungsexperimente haben gezeigt, dass 0,1 M Alfatoxin B1 eine signifikante positive (≥2,0-fache Zunahme) genotoxische Reaktion in 3D HepG2 Lebersphäroide induziert und somit in jedem Mikrokern-Assay verwendet wird, der mit diesem Modell durchgeführt wird. Um die Gültigkeit der Mikrokern-Assay-Ergebnisse mit dem HepG2-Sphäroidmodell zu gewährleisten, sollte die Hintergrundmikrokernfrequenz für HepG2-Zellen, die in diesem 3D-In-vitro-Modell verwendet werden, in einem Bereich von 0,6 % – 1,2 % liegen. Infolgedessen sollte Alfatoxin B1 eine genotoxische Reaktion auslösen, die mindestens doppelt so hoch ist als die mit der Negativkontrolle gesehene; Daher sollten 0,1 M Alfatoxin B1 eine Mikronuklei-Frequenz zwischen 1,5 % – 3,0 % induzieren. Mit diesen Kontrollparametern kann die ENM-assoziierte Genotoxizität in vitro zuverlässig beurteilt werden. Auf der Grundlage der OECD-Testleitlinie 487 ist zu beachten, dass bei der Prüfung eines ENM oder einer Chemikalie die ausgewählten Konzentrationen nicht mehr als 55 % ± 5 % Zytotoxizität (angezeigt durch eine Verringerung der CPBI- oder RVCC-Werte in Bezug auf die Negativkontrolle)11induzieren sollten. Abbildung 7 zeigt die Daten, die bei der Bewertung von Aflatoxin B1 und zwei ENMs (Titandioxid (TiO2) und Splitter (Ag)) nach akuten und langfristigen Expositionen in den HepG2-Sphäroiden und anschließender genotoxischer Potenziale mit hilfe des Mikrokern-Assays generiert wurden. Beide enMs wurden bei einer akuten (24 h) Exposition und einer langfristigen Exposition (120 h) mit einer nichtzytotoxischen, niedrigen Dosis von 5,00 g/ml getestet. Ein ähnlicher Trend zur Genotoxizität sowohl bei TiO2 als auch bei Ag ENMs ist zu beobachten, wobei die erhöhte Genotoxizitätsreaktion, die nach einer 24-h-Exposition resultierte, nach einer langfristigen Exposition von 5 Tagen nicht erkennbar war. Dies trotz anhaltender Genotoxizität, die durch die Aflatoxin B1-Positivekontrolle an beiden Zeitpunkten induziert wurde.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Abbildung 7: Genotoxizitätsbewertung nach TiO2 und Ag ENM-Exposition bei HepG2-Lebersphäroiden. Genozid (Mikrokernfrequenz) Bewertung mit dem Mikrokern-Assay-Post (A) akut (24 Stunden) und (B) Langzeit-(120-Stunden)-Exposition bei 5,00 g/ml TiO2 und Ag ENM. Negativkontrolle ist nur ein Medium, während die positive Kontrolle 0,1 m Aflatoxin B1 beträgt. Mittelwertdaten (n=2) ± SD dargestellt. Bedeutung, die in Bezug auf die Negative Kontrolle angegeben ist: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Aufrufe.  Swansea University Medical School. Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Serie: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

Studie von viralen Vektoren in einem dreidimensionalen Modell der Leber neu besiedelt mit dem menschlichen hepatozellulären Karzinom-Zelllinie HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Forschung

Krebsforschung

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Biotechnik

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Die Dimethylnitrosamin Induced Liver Fibrosis Modell in der Ratte

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medizin

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

3D-Bildgebung der extrazellulären Matrix der Leber in einem Mausmodell der nicht-alkoholischen Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...