Die meisten Experimente untersuchen Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen, indem sie sich auf die Kolonisation konzentrieren, aber unser Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Besiedlung als auch die Erhaltung der Bakterien an der Wurzel zu untersuchen. Wir können das Experiment an verschiedene Bakterien und Pflanzen anpassen, und wir können sogar mehrere Bakterien in jeder 24-Well-Platte testen. Verwenden Sie zunächst einen Standardlochstanzer, um Scheiben aus Kunststoffgewebe zu erstellen.
Sammeln Sie die Scheiben in einem Glasbehälter, und decken Sie lose. Sterilisieren Sie mit einem Autoklaven, der auf einen 20-minütigen Trockenzyklus eingestellt ist. Verwenden Sie eine flammensterilisierte Pinzette, um etwa 40 sterilisierte Netzscheiben in einer einzigen Schicht über die Oberfläche der zuvor vorbereiteten Pflanzenwachstumsmedium-Agarplatte zu verteilen.
Legen Sie zwei zuvor sterilisierte Samen in die Mitte jedes Netzes. Versiegeln Sie die Platte mit chirurgischem Klebeband und bebrüten Sie für zwei bis sechs Tage bei vier Grad Celsius in der Dunkelheit, um die Samen zu vernalisieren. Dann legen Sie die Platte Agar-Seite nach unten in einer Pflanzenwachstumskammer für acht bis zehn Tage unter kurztägigen Einstellungen von neun Stunden Licht bei 21 Grad Celsius und 15 Stunden Dunkelheit bei 18 Grad Celsius zu keimen und Zusaitlinge anzubauen.
Fügen Sie einen Milliliter bakterielles Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Platte hinzu. Um die in Mesh eingebetteten keimten Sämlinge zu übertragen, verwenden Sie flammensterilisierte Zangen, um das Netz mit zwei keimenden, gleich großen und unbeschädigten Sämlingen vorsichtig auf und von der Agarplatte zu schälen. Übertragen Sie einen Schwimmer mit Sämlingen auf jeden Brunnen der bakteriellen Wachstumsflüssigkeit, Wurzelseite nach unten.
Als nächstes, resuspend Bakterien über Nacht auf Agar-Platten in flüssigen bakteriellen Wachstumsmedium gewachsen. Fügen Sie 10 Mikroliter bakterielle Suspension zu jedem Brunnen, mit Ausnahme von Medien-only Kontrollbrunnen, für eine endgültige Konzentration von einer Million koloniebildenden Einheiten von Bakterien pro Brunnen. Um die Platte für steriles Wachstum zu versiegeln, drücken Sie vorsichtig gasdurchlässige Folie über die Platte, ohne die klebrige Seite zu berühren.
Setzen Sie druckauf jeden der Von den Brunnen hergestellten Ringe, um sicherzustellen, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt wurde. Dann schließen Sie die Platte mit ihrem Kunststoffdeckel kuschelig über die gasdurchlässige Folie. Legen Sie die Platte in eine Pflanzenwachstumskammer auf einem Orbitalplatten-Shaker, der auf 220 U/min eingestellt ist, und brüten Sie 18 Stunden unter den gleichen Bedingungen, wie die Sämlinge ursprünglich gekeimt wurden.
Um alle Schwimmer mit Pflanzen zu spülen, fügen Sie einen Milliliter steriles Wasser zu jedem Brunnen einer neuen 24-Well-Platte hinzu. Gasdurchlässige Folie mit Pflanzen von der Platte entfernen und mit sterilen Zangen Schwimmer in Brunnen mit Wasser übertragen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung inkubieren. Dann füllen Sie jeden Brunnen einer neuen 24-Well-Platte mit einem Milliliter Pflanzenwachstumsmedium.
Übertragen Sie ein Netz auf jeden Brunnen und decken Sie mit einer gasdurchlässigen Dichtung ab. 72 Stunden auf dem Orbitalplatten-Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute in der Pflanzenwachstumskammer inkubieren. Nach der Inkubation spülen Sie die Pflanzen wie bisher.
Entfernen Sie nach dem Spülen die Sämlinge aus dem Netz, indem Sie die flammensterilisierten Zangen vorsichtig unter die Blätter auf der Blattseite des Netzes legen. Kneifen Sie den Stiel leicht und wackeln Sie die Sämlinge nach oben und weg aus dem Netz, um die Wurzel zu lösen, ohne sie zu brechen. Um Bakterien von Pflanzenwurzeln zu entfernen, übertragen Sie Sämlinge aus jedem Netz in einzelne Brunnen einer 24-Well-Beschallungsplatte, die einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser enthält.
Beschallen Sie alle Proben innerhalb der Platte auf einmal mit einem mehrgleisigen Beschallungsgerät, wie im Manuskript beschrieben. Um die Bakterien zu quantifizieren, führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen der beschallten Proben in bakteriellem Wachstumsmedium durch. Mit sterilen Glasperlen verteilen und bei der optimalen Temperatur für Bakterien bebrüten, bis einzelne Kolonien zählbar sind.
Um intakte Pflanzenwurzel zu sammeln, verwenden Sie Zangen, um die Sämlinge aus dem Netz zu entfernen. Übertragen Sie dann jede Pflanze auf ein Mikroskop-Dia, indem Sie die Spitze der Wurzel auf dem Dia platzieren und sie von der Spitze wegziehen, um den Abschuss bündig mit dem Dia zu setzen, um eine begradigte Wurzel für beste Bildgebung zu gewährleisten. Fügen Sie jeder Probe einen Tropfen Wasser oder ein steriles Pflanzenwachstumsmedium hinzu, um die Schnittstellen zwischen den Abdeckungen und Rutschen zu hydratisieren.
Legen Sie einen Glasdeckel direkt über der Wurzelkrone und unter den Triebblättern, um eine Schräglage des Deckels zu vermeiden, und drücken Sie vorsichtig nach unten. Dann stellen Sie die Bakterien mit geeigneten Anregungs-/Emissionsfiltern ab, um Bakterien voneinander und der Pflanzenwurzel zu unterscheiden. Pseudomonas simiae, natürlich fluoreszierendes Bakterium, kolonisierte Arabidopsis thaliana Wurzeln und wurde auf der Wurzel nach dem Transfer auf Pflanzenwachstumsmedium beibehalten.
Wurzelkrone, mittellange und Spitze zeigen Fluoreszenz durch Besiedlung von Pseudomonas simiae. Die no-bacteria negative Kontrolle zeigte keine Besiedlung. Wenn Pseudomonas simiae auf Arabidopsis thaliana Wurzeln nach 18 Stunden Kolonisation oder 72 Stunden Wartung quantifiziert wurden, zeigte die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten pro Sämling zu einem oder anderen Zeitpunkt eine gute Reproduzierbarkeit über biologische Repliken hinweg, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.
Es gab einen Anstieg der Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Sämling nach 72 Stunden im Pflegemedium, im Vergleich zu den Zahlen, die am 18-Stunden-Zeitpunkt nach der Kolonisation beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass das aktive Wachstum der kolonisierten Bakterien auf der Pflanzenwurzel während der Erhaltungsphase auftrat. Drei Arten von Bakterien isoliert aus Arabidopsis thaliana in natürlichen Boden unter Laborbedingungen gewachsen wurden verwendet, um die Assoziation von mehreren Arten auf Pflanzenwurzeln zu überwachen. Sie wurden auf Medien, die X-gal enthalten, aufgrund von Unterschieden in der Koloniemorphologie und Farbe deutlich unterschieden, was es erlaubte, die koloniebildenden Einheiten pro Sämling jeder Art ohne Antibiotikaauswahl zu zählen, selbst in der Mehrartenkokultur.
Diese drei Bakterienarten wurden alle besiedelt und an der Wurzel gehalten, ob allein oder in bakterieller Kokultur. Jede Art zeigte Trends, die in verschiedenen biologischen und technischen Replikationen ähnlich waren, was zeigt, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um sowohl relative als auch vollständige koloniebildende Einheiten pro Wurzel jeder Art zu messen. Wenn sie allein angebaut wurden, zeigte keine einzelne Art während der Erhaltungsphase einen erheblichen Anstieg des Überflusses, aber die gesamten koloniebildenden Einheiten pro Wurzel der kombinierten Gemeinschaft nahmen in Kokulturen zu, was darauf hindeutet, dass diese Bakterien die Besiedlung der anderen Stämme nicht verbieten.
Die schwierigsten Schritte sind diejenigen, die das Entfernen intakter Pflanzen aus den Netzscheiben erfordern. Geduldig und sanft zu sein, wird dies möglich machen. Wenn die Bakterienzellen fluoreszierend sind, könnten die Proben nach Durchflusszytometrie sortiert werden, um die relative Anzahl der Zellen zu bestimmen.
