Dieses Protokoll beschreibt, wie man Würmer züchtet und Mikrokosmen kompostiert, was die Erforschung von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen in einem natürlichen Kontext ermöglicht. Diese Methode bietet eine Alternative zur Isolierung von Wildwürmern aus der Natur oder zur Verwendung synthetischer mikrobieller Gemeinschaften mit begrenzter mikrobieller Vielfalt. Dieses Protokoll ist unkompliziert und kann in jedem Labor durchgeführt werden und ist sogar für Anfänger geeignet.
Um zu beginnen, erhalten Sie Kompost oder Gartenerde aus einer geeigneten Quelle und lagern Sie sie im Labor in einem Standard-Küchenkunststoffbehälter mit Löchern im Deckel zur Belüftung. Verstopfen Sie die Löcher mit Watte, um Fruchtfliegen und andere wirbellose Tiere fernzuhalten. Reichern Sie den Kompost oder Boden mit gehackten Produkten oder einer Mischung verschiedener Produkte im Boden an, um ein Verhältnis von zwei zu eins nach Masse zu erzeugen.
Mischen Sie den Kompost einmal täglich und fügen Sie M9-Medium nach Bedarf hinzu, um die Feuchtigkeit zu erhalten, ohne ihn schlammig zu machen. Für jeden Mikrokosmos 10 Gramm angereicherten Kompost in ein mit Alufolie bedecktes 30-Milliliter-Glasbecherglas geben. Fügen Sie 30 Gramm angereicherten Kompost zu jedem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu.
Füllen Sie das Röhrchen mit M9 und Vortex. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 560 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette die Überstände, ohne das Pellet zu stören, und kombinieren Sie sie in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen.
Konzentrieren Sie den Bakterienextrakt, indem Sie das Röhrchen bei maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Pellets in genügend M9, um 200 Mikroliter für jeden Mikrokosmos und 200 Mikroliter für eine Platte zu haben, die als sichtbarer Proxy für Mikrokosmen dient. Geben Sie 200 Mikroliter des konzentrierten mikrobiellen Extrakts in das autoklavierte Kompostbecherglas und die sichtbare Proxy-NGM-Platte.
Fügen Sie jedem Mikrokosmos und der Proxyplatte 500 bis 1000 L1-Larven hinzu. Ein zylindrisches PVC-Rohr mit Seidenpapier auskleiden. Dieser Zylinder sollte ein ein Millimeter Nylonnetz haben, das unten im Trichter verklebt ist.
Legen Sie den Zylinder in den Baermann Trichter und sitzen Sie in einem Kolben. Fügen Sie dem Wurmmikrokosmos 20 Milliliter M9 hinzu. Rühren Sie die Mischung und gießen Sie die Mischung dann aus dem Becherglas in den mit Seidenpapier ausgekleideten Zylinder im Baermann Trichteraufbau.
Tauchen Sie den Kompost vollständig in den Trichter, indem Sie mehr M9 hinzufügen. Lösen Sie die Klemme, um das Filtrat mit den geernteten Würmern in ein 50-Milliliter-Röhrchen freizugeben. Dann konzentrieren Sie die Würmer, indem Sie das Röhrchen bei 560 G für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Wiederholen Sie diese Schritte und ziehen Sie die Filtrate aus verschiedenen Runden, wenn mehr Würmer gewünscht werden.
Entfernen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette, während Sie 15 Milliliter im Röhrchen belassen. Die restliche Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und eine Minute lang erneut zentrifugieren, um die Würmer weiter zu konzentrieren. Entfernen Sie 14 Milliliter des Überstands mit einer serologischen Pipette.
Sammeln Sie gleichzeitig ein Gramm des verbleibenden Mikrokosmosbodens in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, während Sie die Bodenproben mit der Umweltbakteriengemeinschaft wie im Manuskript beschrieben bearbeiten. Einen Milliliter der konzentrierten geernteten Würmer mit einer Glaspipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Zwei Minuten lang inkubieren, damit sich die Würmer am Boden der Röhre absetzen können.
Entfernen Sie den Überstand, während Sie 100 Mikroliter des Pellets ungestört am Boden des Röhrchens lassen. Waschen Sie das Pellet mit 1,5 Milliliter M9 plus Triton X, damit sich die Würmer jedes Mal am Boden absetzen können. Die gewaschenen Würmer in einem Volumen von 100 Mikrolitern mit einer Glaspipette in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr überführen.
Um die Würmer zu lähmen, fügen Sie 100 Mikroliter 25 Millimolar Levamisolhydrochlorid hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 Mikroliter 4% Bleichlösung hinzu und inkubieren Sie für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, wobei die untersten 150 Mikroliter ungestört bleiben, und waschen Sie das Schneckenpellet dreimal mit M9 plus Triton X.Diese oberflächensterilisierten Würmer können bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert und später für nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden.
Der Vergleich der Wurm-Darm-Mikrobiome und Umweltgemeinschaften unter Verwendung einer prinzipiellen Koordinatenanalyse basierend auf der ungewichteten oder gewichteten UniFrac-Entfernung zeigte eine deutliche Clusterbildung von Wurm-Darm-Mikrobiomen weg von denen in ihrer jeweiligen Umgebung. Während die prinzipielle Koordinatenanalyse auf der Grundlage ungewichteter UniFrac-Abstände nicht zwischen Boden- und Wurmmikrobiomen unterschied, zeigte die Clusterbildung basierend auf gewichteten Abständen eine klare Trennung von Wurmdarm- und Kompostmikrobiomen. In dieser Studie wurden Würmer, die in Kompostmikrokosmen gezüchtet wurden, für die 16S-Sequenzierung verwendet, können aber auch verwendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Umweltmikrobiome auf die Resistenz des Wirts gegen widrige Bedingungen zu testen.
Alternativ können neuartige bakterielle Taxa aus Würmern isoliert werden, die aus Kompostmikrokosmen gewonnen werden, um die bekannte taxonomische und funktionelle Vielfalt von Wurm-Darmkommensalen zu erweitern. Nach seiner Entwicklung erleichterte die Mikrokosmen-Pipeline die Bewertung der Beiträge von genetischen Faktoren der Umwelt gegenüber dem Wirt bei der Gestaltung des Darmmikrobioms.
