Diese Methode wird es forschern ermöglichen, die zelluläre Lebensfähigkeit unabhängig von der mitochondrialen Funktion zu beurteilen. Und es ist für Hohe Durchsatz Drogen-Screening-Bemühungen zugänglich. Diese Technik ist schnell, präzise, kostengünstig und ermöglicht die Bestimmung von Verbindungen Zytotoxizität, einschließlich der erdenklichen mitochondrialen Funktionen in den meisten Zelltypen.
Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen. Es ist wichtig, auf die Arzneimittelzubereitung, Behandlungsbedingungen und Zelldichte zu achten, um experimentelle Genauigkeit und Gültigkeit zu gewährleisten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da Schritte zur Bildaufnahme und Bildanalyse schwer rekapitulieren können, insbesondere für Forscher, die wenig Erfahrung mit Gen5 Software haben.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Lösungen der Verbindungen von Interesse in der gewünschten Konzentration. Achten Sie immer darauf, Verbindungen durch gründliches Wirbeln zu mischen. Um die Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung zu messen, bereiten Sie Verbindungen in der 2x enzielligen Konzentration vor.
Wenn Sie die Zytotoxizität von zusammengesetzten Kombinationen messen, bereiten Sie sie in einer 4-fachen Endkonzentration vor. Bereiten Sie lösungsmittelsteuern nur vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Sammeln Sie Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr und aliquot 10 Mikroliter der Zellsuspension.
Für Trypan-Blaufärbung 10 Mikroliter 0,4%Trypan blau in das Aliquot geben und ein Hämozytometer oder einen Zellzähler verwenden, um lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen zu zählen. Pelletzellen in der 15 Milliliter Tube bei 200 mal G für fünf Minuten, dann aspirieren oder decampierten den Überstand. Wir suspendieren das Zellpellet in Essay geeigneten Medien bei einer Zelldichte von dreimal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte zu säen. Für einzelne zusammengesetzte Assays, fügen Sie 50 Mikroliter 2X Compound-Lösung in jedem Brunnen. Für Lösemittelkontrollbrunnen 15 Mikroliter Testmedien hinzufügen, die das Lösungsmittel in 2-facher Konzentration enthalten.
Für Kombinationstests fügen Sie 25 Mikroliter jeder der 4X-Verbindungen in jeden Brunnen. Für einzelne Compound-Kontrollbrunnen, fügen Sie 25 Mikroliter jeder 4X Zusammengesetzten Lösung und Testmedium. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Konzentration von DMSO 0,5% nicht überschreitet, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, fügen Sie Medikamente mit den Pipettenspitzen hinzu, die die Seite der Brunnen berühren.
Achten Sie darauf, die Medikamente an verschiedenen Orten hinzuzufügen. Diese Stiche sollten sehr schnell durchgeführt werden, vorzugsweise nicht länger als 30 Minuten pro Platte. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um den Inhalt der Brunnen zu mischen und bebrüten sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Wenn sie bereit sind, die Zellen mit Hoechst 33342 und Propidiumiodid zu färben, bereiten Sie eine frische 10-fache Färbelösung zu und fügen Sie jedem Brunnen 10 Mikroliter hinzu. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und bebrüten sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 mal G für vier Minuten, um alle Zellen an den Boden der Platte zu bringen.
Wischen Sie dann den Boden der Platte vorsichtig mit einem feuchten Labortuch ab, um Schmutz zu entfernen, der die Bildgebung stören kann. Stellen Sie die Platte innerhalb von 15 Minuten nach der Zentrifugation ab. Öffnen Sie Gen5 Software und erstellen Sie ein neues Standardprotokoll, klicken Sie auf Verfahren und wählen Sie die Art der zu verwendenden Platten aus.
In der Regel 96 gut schwarze Kunststoffplatten. Legen Sie als Nächstes die Lesemethode auf Bild fest, klicken Sie auf Okay, und wählen Sie DAPI- und Texas Red Filter-Sets mit einem 4X Vergrößerungsziel aus. Es ist kein Offset erforderlich, da die Brunnenzentren abgebildet werden.
Stellen Sie für den DAPI-Filter die LED auf 10, die Integrationszeit auf 99 und den Gain auf Null ein. Für Texas Red, stellen Sie LED auf acht, Integrationszeit auf 950, und gewinnen Sie auf 18. Klicken Sie auf Optionen, um sicherzustellen, dass der Autofokus auf dem DAPI-Kanal durchgeführt wird und es keinen Versatz bei der Fokussierung zwischen kanälen gibt.
Speichern Sie das Protokoll, indem Sie auf Okay klicken. Jetzt können Bilder mit der Schaltfläche "Neu lesen" aufgenommen werden. Sobald Bilder aufgezeichnet wurden, klicken Sie auf Datenreduktion und wählen Sie Bildvorverarbeitung.
Wenden Sie die Bildvorverarbeitung mit dunkler Hintergrundsubtraktion mithilfe der automatischen Abflachungsgröße basierend auf dem DAPI-Signal an. Verwenden Sie für Texas Red die gleichen Optionen wie für Kanal 1. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Okay.
Gehen Sie dann zum zellulären Analysepanel und wenden Sie eine Nuklearmaske auf Basis des transformierten DAPI-Signals mit einem Schwellenwert von 6.000 Einheiten, einer minimalen Objektgröße von fünf Mikrometern und einer maximalen Objektgröße von 25 Mikrometern an. Analysieren Sie das gesamte Bild, schließen Sie primäre Kantenobjekte am Rand des Bildes aus und teilen Sie berührende Objekte. Legen Sie bei erweiterten Erkennungsoptionen den Rollenkugeldurchmesser auf 30 Mikrometer fest, und bewerten Sie den Hintergrund basierend auf 5 % der niedrigsten Pixel.
Behalten Sie die Zellenanzahl nur in berechneten Metriken bei. Führen Sie danach eine Subpopulationsanalyse basierend auf dem mittleren transformierten Texas Red-Signal mit einem Schwellenwert von 5.000 Einheiten durch, um abgestorbene Zellen zu zählen. Greifen Sie schließlich auf die resultierenden Zellenanzahlen zu.
Repräsentative Bilder von zellen, die mit Hoechst, Propidiumiodid gefärbt sind, sind hier zu sehen. Die Gesamtzahl der Zellen ist relativ hoch und größer als die Anzahl der abgestorbenen Zellen. Wenn ein Panel von Zytotoxizitäts-Assays mit Trypan-Blau-Ausschluss verglichen wurde, wurde festgestellt, dass MTT und die Alamar Blue Assays die Zelllebensfähigkeit ungenau gemessen haben.
Diese mitochondrialen enzymbasierten Assays zeigten eine signifikant geringere Lebensfähigkeit im Vergleich zum Trypan-Blau-Ausschluss. Die doppelte Färbung mit Hoechst 33342 und PI hatte die beste Kombination aus Robustheit, Empfindlichkeit und Konsistenz mit Trypan-Blaufärbung und der kleinsten medianen Abweichung von der Trypan-Blau-Ausschlussmethode nach CCP- oder 2-DG-Behandlung. Der Hochst PI-Aufsatz war auch wirksam bei der Bestimmung der zellulären Lebensfähigkeit nach der Behandlung mit den Mitochondrien, die auf die Moleküle Rotenon und drei Bromopyruvat abzielten.
Es wurde weiter mit einem Panel von Leukämie-Zelllinien validiert. Diese Zellen variierten in Der Rotenon-Empfindlichkeit, die von sehr empfindlichen bis zu Resistenzzellen reichte. Unsachgemäße Leistung des Testes kann seine Genauigkeit beeinträchtigen.
Mehrere kompromittierte Ergebnisse werden hier gezeigt. Eine Überfärbung mit PI, die Vernachlässigung des Zentrifugationsschritts oder die Überbelichtung im Hoechst-Kanal führen zu suboptimalen Ergebnissen. Während Timing dieses Protokoll, denken Sie daran, die Farbstoffkonzentration und Färbezeit für jede Zelllinie zu optimieren.
Auch die Zentrifikation für eine Probenplatte ist notwendig, um die Bildqualität zu gewährleisten. Nach der Identifizierung von Verbindungen der Zytotoxizität setotoxizitätswirkung auf Krebszellen können Forscher mit mechanistischen Studien fortfahren, um ihre relevanten Ziele zu identifizieren. Das Screening kleiner Molekülbibliotheken mit dieser Technik parallel zu herkömmlichen MTT-Assays ermöglicht es Molekülen, die auf die mitochondriale Funktion abzielen, schnell identifiziert zu werden.
