Dieses Protokoll hilft, die 3D-Struktur neuromuskulärer Verbindungen mit einer Auflösung nahe der Elektronenmikroskopie mit einem einfachen Verfahren quantitativ zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass Muskelproben für die konfokale und STED-Mikroskopie ähnlich verarbeitet und immunmarkiert werden, wodurch die Zeit für die genaue Bewertung der neuromuskulären Verbindungsstruktur in Tiermodellen verkürzt wird. Die von uns entwickelte morphologische Quantifizierung kann leicht angepasst werden, um andere subzelluläre Strukturen zu analysieren.
Es ist mir eine Freude, Dr. Martina Marinello, eine Wissenschaftlerin aus meinem Team, vorzustellen, die zeigen wird, wie Muskelnecken und Immunfärbungen durchgeführt werden, und einige Empfehlungen für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls geben wird. Ich freue mich, Dr. Jeremie Cosette von der Bildgebungsplattform von Genethon vorzustellen, der die Bildaufnahme und -analyse mit konfokalen und STED-Mikroskopen zeigen wird. Nach der Euthanasierung beginnen Sie, die Tibialis-vorderen Muskeln in kleinen Faserbündeln von etwa einem Millimeter Breite mit zwei feinen gezackten Pinzetten zu necken.
Dann übertragen Sie diese Muskelbündel in eine 24-Well-Platte mit 1% Triton X-100, die in PBS hergestellt wurde, und lassen Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur oder fünf Stunden bei vier Grad Celsius sanft rühren. Nach dreimaligem Waschen der Proben für fünf Minuten mit PBS bei Raumtemperatur inkubieren die Proben mit einer Blockierlösung aus 4%BSA, die in PBS mit 1% Triton X-100 hergestellt wurde, vier Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren. Dann inkubieren Sie die Proben über Nacht mit der gleichen Blocklösung, die primäre monoklonale Antikörper gegen entweder Neurofilament M oder synaptisches Vesikelglykoprotein 2 enthält, um präsynaptische Axonterminals bzw. aktive Zonen zu markieren.
Am nächsten Tag waschen Sie die markierten Muskelbündel dreimal für fünf Minuten mit PBS unter sanftem Rühren. Dann inkubieren Sie sie mit geeigneten sekundären Antikörpern, indem Sie sie für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Nachdem Sie die Muskelbündel erneut gewaschen haben, legen Sie sie auf einen Schieber mit Montagemedium.
Legen Sie dann einen 1,5-Grad-Glasdeckel auf die Oberseite, gefolgt von zylindrischen Magneten auf beiden Seiten des Objektträgers, um Druck auszuüben und die Muskeln abzuflachen. Um Bilder mit dem konfokalen Mikroskop zu erfassen, starten Sie die Mikroskopsoftware und wählen Sie Maschine als Konfigurationsmodus und sammeln Sie Bildstapel der neuromuskulären Verbindungen in jeder experimentellen Gruppe gemäß den im Textmanuskript genannten Einstellungen. Klicken Sie am Ende der Sitzung auf Im 3D-Viewer öffnen und wählen Sie eine neuromuskuläre Verbindung, die für eine experimentelle Gruppe repräsentativ ist, um die 3D-Beschriftung zu visualisieren.
Wählen Sie im neuen Popupmenü "Bildtyp" das Format der Z-Stack-Erfassungen aus. Wählen Sie den RGB-Kanal aus, der der gewünschten Färbung entspricht, und geben Sie X, Y-Pixelgröße und Z-Schritt an. Wenn proprietäre Dateiformate ausgewählt sind, liest das Makro direkt die Pixelgröße und den Z-Schritt.
Um den Abstand zwischen den Acetylcholinrezeptorstreifen zu berechnen, wählen Sie das Menü Quantifizieren oben im mittleren Fenster. Klicken Sie auf die Registerkarte Extras, wählen Sie Intensität und klicken Sie auf das Linienprofilsymbol. Setzen Sie Oversampling auf eins und aktivieren Sie Kanäle sortieren.
Klicken Sie auf die Registerkarte Projekte öffnen und wählen Sie das gefilterte Bild aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie dann auf das Symbol "Linie zeichnen" und zeichnen Sie eine Linie nach, die senkrecht mehrere Streifen oder Verbindungsfalten kreuzt. Klicken Sie auf die Spitze des ersten Gipfels und bewegen Sie den Mauszeiger mit gedrückter linker Maustaste, bis der nächste maximale Gipfel erreicht ist.
Beachten Sie den DX-Wert, der dem Abstand zwischen den beiden Spitzen entspricht. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während Sie sich im Bild des rechten Fensters befinden, und wählen Sie ROIs speichern. Nachdem Sie auf das Pfeilsymbol geklickt haben, klicken Sie auf den ROI und löschen Sie ihn, indem Sie auf das Papierkorbsymbol klicken.
Um die Breite des Acetylcholinrezeptorstreifens zu berechnen, wählen Sie die Intensität oben links unter der Registerkarte Extras, klicken Sie auf das Symbol FWHM bestimmen und aktivieren Sie die Sortierkanäle. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Projekte öffnen und wählen Sie das gefilterte Bild aus, das analysiert werden soll. Klicken Sie anschließend auf das Symbol zum Zeichnen des Rechtecks im oberen Menü des rechten Fensters.
Wählen Sie einen horizontalen oder vertikalen Streifen aus, und zeichnen Sie ein Rechteck senkrecht zum Streifen. Im mittleren Fenster wird ein Profil angezeigt. Klicken Sie im Menü "Durchschnittliche Projektion" im linken Bereich auf "Vertikal" oder "Horizontal", je nachdem, ob die Streifenausrichtung vertikal oder horizontal ist.
Klicken Sie auf die Statistik im zentralen Fenster, um den FWHM-Wert zu lesen und dann die ROIs wie zuvor demonstriert zu speichern und zu löschen. Die postsynaptische motorische Endplatte, markiert mit fluoreszierendem alpha-Bungarotoxin, erschien in den Mutanten zweier Mauslinien kleiner und fragmentiert. Die Quantifizierung der neuromuskulären Junction-Z-Stacks mit den kundenspezifischen Image J-Makros zeigte eine deutliche Abnahme des Endplattenvolumens, der maximalen Intensitätsprojektion und der relativen Tortuosität in beiden Krankheitsmausmodellen im Vergleich zu Kontrollen, was auf neuromuskuläre Verbindungsreifungsdefekte hinweist.
Die Quantifizierung der präsynaptischen axonterminalen Zweigverteilung mit dem benutzerdefinierten Makro Image J zeigte ein verändertes Muster in der Neurofilament-M-Verteilung in den beiden Tiermodellen mit erhöhter Immunmarkierung. Durch synaptische Vesikel-Glykoprotein-2-Färbung wurde bei Smn 2B/Mäusen eine 43%ige Reduktion des Belegungsverhältnisses der Acetylcholinrezeptor-haltigen Regionen mit benachbarten nerventerminalen aktiven Zonen beobachtet. Der Aspekt der postsynaptischen Endplatten der neuromuskulären Verbindung wurde durch fluoreszierende alpha-Bungarotoxin-Markierung und Intensitätsprofilanalyse deutlich visualisiert.
Die Auswertung der neuromuskulären Verbindungsparameter ergab eine Zunahme des Verbindungsfaltenabstands und der Breite der Acetylcholinrezeptorstreifen im Musculus gastrocnemius der Mutanten. Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Muskeln richtig zu straffen und besonders auf die angewandte Kraft zu achten, um Muskelbündel zu trennen. Dieses Protokoll kann zu einer tiefergehenden morphologischen Charakterisierung der neuromuskulären Verbindung beitragen, die bisher nur durch komplexe und zeitaufwändige Verfahren wie die Transmissionselektronenmikroskopie erklärt wurde.
Das STED-Bildgebungsverfahren ebnete den Weg für die Untersuchung neuer Erkenntnisse über prä- und postsynaptische Marker, die zur Pathophysiologie von Erkrankungen beitragen, die die neuromuskuläre Verbindung betreffen.
