Der Autor dankt Doug für seine ständige Ermutigung und unerschütterliche Unterstützung sowie den Mitgliedern des Melton-Labors für ihr hilfreiches Feedback und ihre Kommentare zum Manuskript. Der Autor möchte auch dem Harvard Office of Animal Resources (OAR) für seine engagierte Tierpflege danken.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit IACUC (Protokoll #: 11-32) und AAALAC-Richtlinien an der Harvard University durchgeführt.
1. Vorbereiten von Lösungen und Setup für Anästhesie und Genesung
<ol><li>Bereiten Sie frische 0,1% ige Tricainlösung für die Anästhesie und 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung zur Wiederherstellung vor. Machen Sie die Lösungen mit Wasser für die Axolotl-Haltung37 gemäß den an der jeweiligen Forschungseinrichtung zugelassenen IACUC-Protokollen (z. B. modifizierte Holtfreter-Lösung) geeignet. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen gut gemischt sind und dass genügend Volumen vorbereitet ist, um das gesamte Axolotl einzutauchen.<ol>
<li>Um 0,1% ige Tricainlösung herzustellen, mischen Sie 1 g Tricain und 1 g Natriumbicarbonat mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden.</li>
		<li>Um 0,5% ige Sulfamerazin-Natriumsalzlösung herzustellen, mischen Sie 5 g Sulfamerazin-Natriumsalz mit 1 L Wasser. Die Lösung kann nach diesem Rezept hochskaliert werden. Sulfamerazin-Lösung ist ein Antibiotikum, das eine bakterielle Infektion während der chirurgischen Genesung verhindert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie ihn mit Clidox-S oder 70% Ethanol besprühen. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (Pinzette, Sezierschere, Federschere) durch Autoklavieren. Wenn Sie mehrere Operationen durchführen, stellen Sie sicher, dass Sie die chirurgischen Werkzeuge mit einem heißen Perlensterilisator zwischen den Tieren sterilisieren.</li>
	<li>Um den Erholungsbereich einzurichten, legen Sie eine 15 cm große Petrischale oder einen beliebigen Behälter, in den der Axolotl passt, auf einen mit Nasseis gefüllten Eimer. Füllen Sie die Petrischale mit einem niedrigen Gehalt von 0,5% Sulfamerazin-Natriumsalzlösung, so dass der Axolotl nicht vollständig untergetaucht wird. Die Erholung auf Eis nach der Operation verlangsamt die Bewegung des Tieres, während es aus der Narkose erwacht, so dass der vernähte Bereich relativ ungestört heilen kann. HINWEIS: Dieses Setup kann von Forschern angepasst werden, je nachdem, welche Materialien sie zur Verfügung haben.</li>
</ol>2. Durchführung des vollständigen chirurgischen Eingriffs des Hautlappens
<ol><li>Anästhesieren Sie den Axolotl, indem Sie ihn in einen Behälter mit 0,1% iger Tricainlösung tauchen. Dies dauert ca. 15-20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass der Axolotl tatsächlich vollständig betäubt ist, indem Sie eine Schwanzprise durchführen. Wenn es keine Reaktion vom Axolotl gibt, fahren Sie mit der Operation fort. HINWEIS: Verwenden Sie für diese Operation ältere, größere Axolotl (mindestens 15 cm groß). Stellen Sie sicher, dass der Axolotl während der gesamten Operation gut hydratisiert bleibt, indem Sie die Haut regelmäßig mit Axolotl-Systemwasser mit einer Kunststoffpipette benetzen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Operationsstelle aseptisch vorbereiten, indem Sie den Bereich vor der Operation mit sterilem PBS bewässern. Das Tier sollte für den Eingriff auch auf einen sterilen chirurgischen Tuch gelegt werden.</li>
	<li>Eine Amputation der Gliedmaßen am distalen Ende der zeugopodialen Skelettelemente wird mit der Sezierschere durchgeführt (Abbildung 1.1).</li>
	<li>Machen Sie mit der Federschere einen kleinen Schnitt (ca. 2 mm) am ventralen Teil der Haut (Abbildung 1.2).</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette vorsichtig bis etwa zur Mittellinie der zeugopodialen Skelettelemente zurück und legen Sie die darunter liegenden Gliedmaßengewebe (Muskeln, Knochen usw.) frei. (Abbildung 1.3). Achten Sie darauf, die Haut nicht zu beschädigen. Siehe Hinweis nach Schritt 2.8.</li>
	<li>Amputieren Sie das freigelegte darunter liegende Gliedmaßengewebe an der Mittellinie des Zeugopoden mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 1.4).</li>
	<li>Drücken Sie das Muskelgewebe mit der chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Dies ist notwendig, um eine verbesserte Heilung zu gewährleisten und auch den Erfolg der Operation zu erhöhen, da hervorstehender Knochen gegen den vernähten Lappen gezackt werden kann und später die Integrität eines intakten Hautlappens stört.</li>
	<li>Ziehen Sie mit der Pinzette vorsichtig die Haut mit voller Dicke über die Amputationsebene, um das freiliegende darunter liegende Gewebe und die Nähte an Ort und Stelle zu bedecken, indem Sie sie mit der ventralen Haut in voller Dicke verbinden (Abbildung 1.5).</li>
	<li>Nähen Sie die verbleibende rechte und linke Seite der Haut in die darunter liegenden ventralen Teile der intakten Haut. Dies kann erreicht werden, indem entweder die Seiten der Klappe "kreuz und quer" genäht werden (empfohlen) (Abbildung 1.6-1.9) oder einfach direkt in die Bauchhaut eingenäht wird. Verwenden Sie die Pinzette und die gebogene Federschere zum Nähen. Stellen Sie sicher, dass keine exponierten darunter liegenden Gewebe zu sehen sind und dass die Nähte fest gebunden sind (mindestens dreimal geknotet). HINWEIS: Es ist wichtig, dass die intakte Haut in den Schritten 2.4, 2.7-2.8 nicht beschädigt wird. Wir haben festgestellt, dass Schäden an der Haut in voller Dicke mit erfolglosen Operationen korreliert sind, da die Schadensbereiche immer noch eine kleine Wundepidermis bilden können. Wenn möglich, versuchen Sie, eine stumpfere Pinzette zu verwenden, wenn Sie die Hautklappe in voller Dicke handhaben.</li>
	<li>Führen Sie eine Amputation an der kontralateralen Extremität durch (optionale interne Tierkontrolle), indem Sie sie auf mittlerer Zeugopodenebene mit einer chirurgischen Schere amputieren. Drücken Sie das Muskelgewebe mit einer chirurgischen Schere zurück und schneiden Sie den freiliegenden Knochen ab. HINWEIS: Eine interne kontralaterale Gliedmaßenkontrolle kann durchgeführt werden, um den Erfolg der Operation während Schritt 4 am selben Tier besser beurteilen zu können. Die Amputation desselben Gliedmaßes bei einem separaten Tier kann jedoch auch als Kontrolle dienen.</li>
</ol>3. Postoperative Genesung und Pflege
<ol><li>Sobald die Operation abgeschlossen ist, legen Sie ein Kimwipe oder ein steriles Papiertuch auf den Boden des Behälters oder der Petrischale, um es zu benetzen. Legen Sie das Tier in den Behälter auf nassem Eis und wickeln Sie die freiliegenden Enden des Kimwipe- oder Papiertuchs vorsichtig um die Oberseite des Tieres, um es mit Sulfamerazinlösung gut hydratisiert zu halten. Lassen Sie es 30 Minuten bis 1 Stunde auf nassem Eis stehen, um eine minimale Bewegung während der Erholung von der Narkose zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen statischen Haltungsbehälter mit 0,5% Sulfamerazinlösung. Axolotls müssen in dieser Lösung für die ersten 24 Stunden bleiben, um eine Infektion zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie den Axolotl in normales Systemwasser und überwachen Sie die Gesundheit täglich. Stellen Sie sicher, dass jeden Tag keine Nähte herausfallen, da dies dazu führen kann, dass sich eine kleine Wundepidermis bildet, die die Ergebnisse verwirren wird. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Gehäusebehälter ausreichend Platz für die Bewegung des Axolotls bietet, und minimieren Sie die Wahrscheinlichkeit, dass die vernähte Extremität am Axolotl mit den Seiten des Behälters in Berührung kommt. Dies wird dazu beitragen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation.</li>
</ol>4. Beurteilung des Operationserfolgs unter dem Stereomikroskop
HINWEIS: Wir empfehlen, die Tiere mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop zu untersuchen, um die Integrität des gesamten Hautlappens und den Erfolg der Operation zu beurteilen.
<ol><li>Betäuben Sie den Axolotl in 0,1% Tricain wie in Schritt 2.1. Stellen Sie sicher, dass im Behälter ausreichend Platz ist, damit sich der Axolotl bewegen kann.</li>
	<li>Wenn Sie in den ersten zwei Wochen nach der Operation inspizieren, untersuchen Sie die vernähte Extremität mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine Nähte herausgekommen sind und dass eine klare dünne Wundepidermis nirgendwo sichtbar ist. Wenn Sie in der dritten Woche nach der Operation oder später inspizieren, stellen Sie sicher, dass sich kein Blastema gebildet hat, und vergleichen Sie mit dem Verlauf der normalen amputierten Kontrollextremität (entweder von demselben Tier oder einem anderen Tier) während der Regeneration (dh ob sich ein Blastema gebildet hat).</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, bringen Sie den Axolotl auf normale Systemwasser- und Haltungsbedingungen zurück.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Durchführung von Operationen mit vollem Hautlappen in Axolotl-Gliedmaßen, um die Bildung von Wundepidermis zu hemmen. Während diese Operation im Vergleich zu anderen Methoden zur Hemmung der Wundepidermisbildung relativ einfach und technisch reproduzierbar ist, gibt es mehrere kritische Schritte, die den Erfolg der Operation beeinflussen können. Erstens, wenn Sie den intakten vollen Hautlappen über das freiliegende darunter liegende Gewebe ziehen, ist es von größter Bedeutung, dass die Haut in voller Dicke in keiner Weise beschädigt wird. Eine Schädigung des Hautlappens kann immer noch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen, die zu einem kleinen blastemartigen Auswuchs führen kann. Zweitens, stellen Sie sicher, dass während der postoperativen Versorgung keine Nähte ausfallen, da dies auch zur Bildung einer kleinen Wundepidermis führen kann. Bis zu diesem Punkt ist es wichtig, den potenziellen Kontakt zwischen der vernähten Extremität und allen Oberflächen zu minimieren, insbesondere in der ersten Woche nach der Operation. Mehrere Möglichkeiten, dies zu verhindern, bestehen darin, den Axolotl in einem ausreichend großen Behälter unterzubringen und zu betäuben, so dass der Axolotl nach der Operation viel Platz hat, um sich zu bewegen.
Diese Operation hat auch mehrere Einschränkungen. Am bemerkenswertesten ist vielleicht, dass der Erfolg von Operationen nur auf zwei Arten beurteilt werden kann: mit dem Sezierbereich während der ersten zwei Wochen der Operation, um nach dem Fehlen einer Wundepidermis zu suchen und / oder zu überprüfen, ob sich innerhalb von 3 Wochen ein Blastema bildet. Während diese Methoden effektiv sind, haben sie einen relativ geringen Durchsatz. Die Entwicklung zukünftiger transgener Reporter-Axolotls für Wundepidermis-spezifische Marker kann zu einem schnelleren Screening auf erfolgreiche und erfolglose Operationen beitragen. Darüber hinaus ist diese Operation bei jüngeren Tieren schwieriger durchzuführen, da die intakte Haut zerbrechlicher ist. Die Verwendung von subadulten oder adulten Axolotls wird daher empfohlen.
Während diese Operation ursprünglich in N. viridiscens19 entwickelt wurde, wurde sie leicht für Axolotls25,39 angepasst und kann wahrscheinlich auch auf andere Salamanderarten angewendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung dieser Technik auf zukünftige regenerative Studien zu Gliedmaßen die Forscher in die Lage versetzen wird, sowohl mehr Werkzeuge zur Behandlung der Wundepidermisbiologie zu entwickeln als auch die zugrunde liegenden Mechanismen zu identifizieren, die ihre Funktion bei der Einleitung der Blastomabildung antreiben.

Seit Lazzaro Spallanzani es 17681 gemeldet hat, ist die Regeneration der Salamandergliedmaßen eines der am besten untersuchten natürlichen regenerativen Phänomene, das Biologen seit Jahrhunderten verliebt. Eine erfolgreiche Regeneration der Gliedmaßen hängt von der Bildung, dem Auswachsen und der anschließenden Musterung einer undifferenzierten Zellstruktur ab, die als Blastema bekannt ist. Forscher haben bedeutende Fortschritte beim Verständnis der zellulären Zusammensetzung des Blastomas gemacht und welche unterstützenden Gewebe und Zelltypen für seine Bildung notwendig sind2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Die koordinierten Signalmechanismen zwischen verschiedenen Geweben und Zelltypen, die zur Initiierung der Blastembildung führen, sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.
Eine Schlüsselvoraussetzung für eine erfolgreiche Blastomenbildung und Regeneration ist die Wundepidermis, ein vorübergehendes und spezialisiertes Epithel, das die Amputationsebene innerhalb von 12 Stunden nach der Amputation abdeckt10. Nach der Amputation wandern Epithelzellen von der intakten Haut proximal zur Verletzung schnell über die Amputationsebene und bilden ein dünnes Wundepithel14. Wenn sich das Blastema in den folgenden Wochen bildet, entwickelt sich die frühe Wundepidermis zu einer dickeren epithelialen Signalstruktur, der apikalen Epithelkappe (AEC)15. Während normale Haut in voller Dicke sowohl eine Epithel- als auch eine Hautschicht enthält, die durch eine Basallamina getrennt sind, besteht die Wundepidermis/AEC nur aus einer Epithelschicht und es fehlt eine Basallamina16,17. Das Fehlen der Basallamina und der Dermis ermöglicht einen direkten Kontakt zwischen den Wundepithelzellen und den darunter liegenden Geweben, was eine bidirektionale Signalübertragung zwischen den beiden Kompartimenten erleichtert, die sowohl für die Blastembildung als auch für die Aufrechterhaltung von Blastemen entscheidend ist17,18.
Klassische experimentelle Studien entwickelten verschiedene innovative chirurgische Methoden, um die Funktion und Notwendigkeit der Wundepidermis / AEC durch Hemmung ihrer Bildung zu untersuchen. Diese Methoden umfassten das Nähen19 oder das Pfropfen der Haut in voller Dicke20,21 über die Amputationsebene, das sofortige Einnähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle22 und die kontinuierliche tägliche Entfernung oder Bestrahlung der frühen Wundepidermis und AEC23,24. Insgesamt stellten diese Experimente nicht nur die Bedeutung der Wundepidermis/AEC fest, sondern bestimmten auch ihre Rolle bei der frühen Gewebehistolyse sowie bei der Aufrechterhaltung der Progenzellproliferation und des blastemalen Auswachsens13 während der gesamten Regeneration.
Diese früheren Studien beschränkten sich jedoch weitgehend auf histologische Färbungen sowie tritiierte Thymidinimpulse, um die Zellproliferation zu verfolgen. Tatsächlich wurde die Überprüfung dieser klassischen Experimente mit modernen Sequenzierungstechnologien und Funktionstechniken bei Salamandern erst kürzlich durchgeführt und hat zur Entdeckung zusätzlicher Rollen für die Wundepidermis bei der Modulation von Entzündungen und ECM-Abbau / -Ablagerung in frühen Stadien der Regeneration geführt25. Mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenom- und Transkriptomsequenzen26,27,28,29,30,31,32,33,34, sowie der wachsenden Anzahl von funktionellen Methoden, die in Salamanderarten verfügbar sind11,35,36,37,38 sind die Forscher nun gut positioniert, um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Bildung, Funktion und AEC-Entwicklung der Wundepidermis antreiben.
Leider sind einige dieser klassischen Methoden, die zur Hemmung der Wundepidermisbildung verwendet werden, technisch anspruchsvoll und stellen im selben Experiment Schwierigkeiten für die Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten dar. Zum Beispiel kann die Aufrechterhaltung von Hauttransplantaten eine Herausforderung sein, da Transplantate schließlich von der Wirtsextremität fallen können und die Entfernung der Wundepidermis / AEC täglich schwierig ist, ohne das darunter liegende Gewebe zu schädigen. Darüber hinaus ist das Nähen der amputierten Extremität in die Körperhöhle eine Herausforderung und erfordert zusätzliche Verletzungen an der Insertionsstelle. Auf der anderen Seite ist das Nähen von Haut in voller Dicke unmittelbar über der Amputationsebene relativ einfach, technisch reproduzierbar und führt zu minimalen Gewebeschäden. Diese Vollhautlappen-Operationsmethode (FSF) wurde bereits 1976 von Anthony Mescher bei erwachsenen Molchen (Notophthalmus viridiscens) entwickelt. Er zeigte, dass die FSF-Operation die Bildung und Funktion der Wundepidermis hemmte, indem sie sowohl die Migration von Epithelzellen über die Amputationsebene als auch den direkten Kontakt zwischen Epithelzellen und den darunter liegenden Geweben verbot.
Hier wird dieser chirurgische Eingriff Schritt für Schritt mit dem Axolotlglied gezeigt. In Verbindung mit modernen Molekular- und Sequenzierungstechnologien kann sich diese Technik für Forscher als sehr hilfreich erweisen, um unser Verständnis der Bildung und Funktion von Wundepidermis / AEC während der Regeneration der Gliedmaßen zu vertiefen.

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassische Experimente in der regenerativen Biologie des Salamanders im letzten Jahrhundert haben seit langem gezeigt, dass die Wundepidermis eine entscheidende Signalstruktur ist, die sich nach der Amputation schnell bildet und für die Regeneration der Gliedmaßen erforderlich ist. Die Methoden zur Untersuchung seiner genauen Funktion auf molekularer Ebene in den letzten Jahrzehnten waren jedoch aufgrund eines Mangels an präzisen funktionellen Techniken und genomischen Informationen, die in Salamander-Modellsystemen verfügbar sind, begrenzt. Aufregenderweise ermöglicht es die jüngste Fülle von Sequenzierungstechnologien, gepaart mit der Freisetzung verschiedener Salamandergenome und dem Aufkommen funktioneller genetischer Testmethoden, einschließlich CRISPR, diese grundlegenden Experimente mit beispielloser molekularer Auflösung erneut zu besuchen. Hier beschreibe ich, wie man die klassisch entwickelte Vollhautlappenoperation (FSF) bei erwachsenen Axolotls durchführt, um die Bildung der Wundepidermis unmittelbar nach der Amputation zu hemmen. Die Wundepidermis bildet sich normalerweise durch distale Migration von Epithelzellen in der Haut proximal zur Amputationsebene, um die Wunde von der äußeren Umgebung abzudichten. Die Operation beinhaltet das sofortige Nähen der Haut in voller Dicke (die sowohl epidermale als auch dermale Schichten umfasst) über der Amputationsebene, um die Migration von Epithelzellen und den Kontakt mit dem darunter liegenden beschädigten mesenchymalen Gewebe zu behindern. Erfolgreiche Operationen führen zur Hemmung der Blastembildung und der Regeneration der Gliedmaßen. Durch die Kombination dieser chirurgischen Methode mit zeitgenössischen nachgelagerten molekularen und funktionellen Analysen können Forscher beginnen, die molekularen Grundlagen der Funktion und Biologie der Wundepidermis während der Regeneration der Gliedmaßen aufzudecken.

Dieses chirurgische Protokoll ermöglicht die vollständige Hemmung der Wundepidermisbildung (Abbildung 1) und letztendlich die Regeneration der Gliedmaßen. Eine erfolgreiche Operation führt in etwa 2-3 Wochen zu keiner Blastembildung, abhängig von der Größe des Tieres, während Kontrollregenerationsgliedmaßen normalerweise ein Blastema bilden sollten.
Forscher sollten das vernähte Glied alle 2-3 Tage mit bloßem Auge untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte nicht herausgesprungen sind und sich kein Blastema bildet. Wenn eine oder mehrere der Nähte herausspringen, kann sich immer noch eine Wundepidermis bilden, die entweder zu einem kleinen oder großen Blastema und einer erfolglosen Operation führt (Abbildung 2). Darüber hinaus sollten Forscher die vernähte Extremität mindestens einmal pro Woche unter einem Stereomikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass eine dünne Wundepidermis nirgendwo auf der Amputationsoberfläche sichtbar ist. Zum Vergleich sollten die Forscher auch die regenerierende Extremität untersuchen, die eine Wundepidermis über der Amputationsebene haben und über 2-3 Wochen ein Blastema bilden sollte. Die Wundepidermis erscheint dünn und klar, während die normale Haut bei Leuzismus-, Albino- oder Wildtyp-Axolotlen undurchsichtiger und blassrosa (fast weiß), hellgelb oder dunkelgrün erscheint.
Wenn Forscher Gewebe vor den Blastomenbildungsstadien nach 2-3 Wochen sammeln möchten, sollten sie die vernähten Gliedmaßen vor der Probenentnahme untersuchen, um sicherzustellen, dass die Nähte an Ort und Stelle bleiben und sich keine kleine Wundepidermis bildet. Darüber hinaus können durch eine sagitale Schnittung durch das vernähte Gliedmaßengewebe und die Durchführung histologischer Analysen zu einem beliebigen Zeitpunkt auch das Vorhandensein der Dermis aus dem gesamten Hautlappen, der die gesamte Amputationsebene umgibt, und das Fehlen einer Wundepidermis überprüft werden (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte der vollständigen Hautlappenoperation. Die Schritte des Protokolls sind hier nummeriert und dargestellt. Die gepunkteten Linien bezeichnen die Amputationsebenen in den Schritten 1 und 3 des Protokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Operationen mit vollem Hautlappen. Repräsentatives Hellfeldbild einer Gliedmaße, die 25 Tage nach der Amputation (dpa) einer erfolgreichen Operation (links), einer erfolglosen Operation (rechts) und einer Kontrollregenerationsextremität (keine Operation) unterzogen wurde. Die erfolgreiche Operation hat eine flache Amputationsebene, auf der der volle Hautlappen vernäht wurde, während sich bei der erfolglosen Operation ein kleines Blastema entwickelt. Pfeilspitzen bezeichnen die Amputationsebene und weiß gepunktete Linien dienen dazu, das Fehlen eines Blastems bei der erfolgreichen Operation und das Vorhandensein von Blastemen bei der erfolglosen Operation zu visualisieren und die regenerierenden Gliedmaßen zu kontrollieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Abbildung 3: Histologische Färbung normaler regenerierender und FSF-vernähter Gliedmaßen. (A-B') Repräsentative Hellfeldbilder von picro-mallory gefärbten Schnitten aus regenerierenden (A-A') und vernähten Axolotlgliedmaßen (B-B') bei 7 dpa. Einsätze in A und B werden in A' bzw. B' dargestellt. Die kollagenschwere Hautschicht kleidet und bedeckt die gesamte Amputationsebene in vernähten Gliedmaßen. Die Amputationsebene wird in A-B durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Maßstabsstäbe repräsentieren 500 μm. Diese Figur wurde von Tsai et al.25 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Hemmung der Wundepidermisbildung durch vollständige Hautlappenchirurgie während der Regeneration der Axolotl-Gliedmaßen

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Aufrufe.  Harvard University. Dieser Artikel beschreibt, wie man eine chirurgische Methode durchführt, um die Bildung von Wundepidermis während der Regeneration der Axolotlgliedmaßen zu hemmen, indem sofort die Haut in voller Dicke über die Amputationsebene näht wird. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die funktionellen Rollen der Wundepidermis in den frühen Stadien der Regeneration der Gliedmaßen zu untersuchen.

Serie: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

Direkter Gene Knock-out von Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Genetik

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Wurzelspitzenresektion Mausmodell zur frühen Säugetierherzregeneration Studieren

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Medizin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Biologie

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

Kontusion Rückenmarksverletzung über eine mikrochirurgische Laminektomie im Regenerativen Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Ein apikales Resektionsmodell im adulten Xenopus tropicalis-Herzen

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verwendung der Plattenfixierung zur Untersuchung der Knochenheilung und Regeneration der Gliedmaßen bei Axolotln

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung der Regeneration bei Axolotln durch Einblicke in zelluläre und molekulare Mechanismen, Knochenheilung und Implikationen für Human

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

Stabilisierung einer Femurosteotomie mit einer Plattenfixation bei Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...