Edhazardia aedis ist ein mikrosporidischer Parasit, der speziell Aedes aegypti Mücken infiziert. Die Aufzucht dieses Parasiten kann für neue Forscher aufgrund der Komplexität des Lebenszyklus des Parasiten eine Herausforderung sein. Dieses Protokoll enthält schrittweise Anweisungen für die Aufzucht von E.aedis, einschließlich der richtigen Zeit der Schritte zum Verfahren, der Identifizierung infektiöser Sporen und der Verbreitung der nächsten Generation von Parasiten.
Das genaue Timing dieses Protokolls kann eine Herausforderung darstellen und einige Versuchs- und Fehler erfordern. Die Identifizierung von Sporen kann auch schwierig sein. Die visuellen Hilfsmittel in diesem Protokoll sollten Hilfe stellung nehmen.
Zu Beginn schlüpfen A.Aegypti Eier mit E.aedis infiziert, indem sie in einem Larvenzuchttablett mit einem Liter entionisiertem Wasser und Hinzufügen von 50 Milligramm Fischfutter. Beherbergen Sie die Mücken bei 27 Grad Celsius und 80% relative Luftfeuchtigkeit mit einem 14-Stunden-Licht, 10-Stunden-Dunkelzyklus. Nach dem Schlüpfen die Larvendichte auf ca. 100 Larven pro Tablett reduzieren, so dass bei Bedarf neue Schalen entstehen.
Fügen Sie jedem Tablett ein Stück trockenes Katzenfutter hinzu. Füllen Sie die Nahrung auf, wenn sie erschöpft sind, aber liefern Sie keine überschüssige Nahrung. Ein 200 Milligramm Katzenfutter alle drei Tage ist ausreichend.
Wenn die infizierten Larven die dritte bis vierte Insterne sind, schlüpfen sie nicht infizierte A.aegypti-Eier in ein neues Tablett. Die Mücken an dichten aufziehen, so dass gesunde A.aegypti in 48 bis 72 Stunden den zweiten bis dritten Platz erreichen. Brutchargen von gesunden Eiern über mehrere Tage können garantieren, dass Larven im richtigen Stadium sind, wenn nötig.
Um uninukleate Sporen zu ernten und zu quantifizieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um 10 infizierte vierte Instar-Larven in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu bewegen. Entfernen Sie das Zuchtwasser mit einer Transferpipette und waschen Sie die Larven einmal, indem Sie etwa einen Milliliter sauberes entionisiertes Wasser hinzufügen. Entfernen Sie das Waschwasser und fügen Sie 500 Mikroliter sauberes deionisiertes Wasser zu den 10 Larven hinzu und homogenisieren Sie sie mit einem Stößel und einem mechanischen Homogenisator.
10 Mikroliter Homogenat auf ein Hämozytometer laden und die Sporen bei 400-facher Vergrößerung quantifizieren. Machen Sie eine frische Larvenfutter Gülle durch Mischen 1,2 Gramm Leberpulver, 0,8 Gramm Bierhefe, und 100 Milliliter Wasser. 100 Sekunden bis dritte inStern gesunde A.aegypti Larven in 150 Milliliter Becher oder Probenbecher übertragen und fügen Sie fünfmal 10 bis vier mal 10 zu den fünften Sporen zu jeder Tasse mit einer Pipette.
Fügen Sie zwei Milliliter Larvenfuttergülle und entionisiertes Wasser für ein Endvolumen von 100 Milliliter hinzu. Nach 12 bis 24 Stunden Belichtungszeit die Larven in Aufzuchtschalen übertragen. Fügen Sie Nahrung hinzu und erziehen Sie sie zum Erwachsenenalter.
Überwachen Sie die dosierten Larven für die Verpupation und übertragen Sie Pupas in einen Aufnahmebecher in einem Käfig. Zucker futter Erwachsene ad libitum. Blutfütterung Von Erwachsenen nach Standardprotokollen, die über BEI Resources verfügbar sind.
Sammeln Sie Eier von blutgefütterten Erwachsenen. Die vertikale Übertragung von E.aedis erfolgt in diesem Schritt. Reinigen Sie nach fertigstellungen Materialien alle Materialien, die mit E.aedis in Berührung kamen, mit 10% Bleichmittel und Autoklavieren, um eine Kontamination zu verhindern.
Dieses Protokoll zeigt das vollständige Verfahren, das erforderlich ist, um E.aedis bei A.aegypti-Mücken zu verbreiten. A.aegypti Eier mit E.aedis infiziert wurden geschlüpft und Larven wurden bis zum vierten instar Stufe aufgezogen. Im vierten Instar-Stadium konnten visuelle Anzeichen einer Infektion beobachtet werden, wie weiße Sporozysten in den Fettkörpern infizierter Larven.
Uninucleate Sporen wurden von vierten Instar Larven geerntet, indem 10 Larven in 500 Mikroliter entionisiertem Wasser homogenisiert wurden. Diese Sporen waren piriform und bei 400X Vergrößerung gut sichtbar. Es wurde eine Sporenzahl von 4.050 Sporen pro Mikroliter berechnet, die verwendet wurden, um gesunde Larven über eine horizontale Übertragung zu infizieren.
Der Infektionsstatus und E.aedis-Ladungen von 25 Larven der filialen Generation wurden nach dem Schlüpfen an sieben Tagen untersucht. Die vertikale Infektionsrate von E.aedis in der kindlichen Generation betrug 96%, und die durchschnittliche Sporenbelastung infizierter Personen bei sieben Tagen nach dem Schlüpfen betrug 3,31 mal 10 bis fünf. Um die Larveninszenierung richtig zu koordinieren, ist es ratsam, eine gewisse Variabilität in der Aufzuchtzeit zu berücksichtigen.
Darüber hinaus nehmen die Sporenzahlen schnell zu, wenn Sie keine Sporen erkennen, versuchen Sie es einfach am nächsten Tag erneut. Viel Glück.
