Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Biopestizids zu beantworten, wie z. B. wie die Wirkungsgenexpression der Doppelstrang-RNA und die Fruchtbarkeit bei erwachsenen Dipteranen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass quantifizierbare Dosen von Doppelstrang-RNA an die Mücke oder Fliege abgegeben werden und daraus resultierende Auswirkungen auf die Mehrgenerationen-Letalität bewertet werden können. Obwohl diese Methode für die Mücke, aedes aegypti und die Hausfliege, musca domestica, vorgestellt wird, kann sie auch auf andere Mücken- und Fliegenarten angewendet werden.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Beherrschung des Injektionsverfahrens selbst eine Zeitinvestition ist. Jedes Insekt mit der optimalen Nadelspitze zu injizieren ist entscheidend, um die Entbindung zu gewährleisten und gleichzeitig Verletzungen und Sterblichkeit zu minimieren. Zunächst sollten Sie Mücken mit Zangen vorsichtig inszenieren, sodass sie schließlich auf einem Mikroskop-Dia etwa einen halben Zentimeter voneinander entfernt ausgesetzt werden.
Um die Handhabung des Schlittens zu unterstützen, lassen Sie einen Ein- bis eineinhalb Zentimeter großen Abstand am linken oder rechten Ende der Rutsche. Dann legen Sie die Rutsche der inszenierten Insekten bei vier Grad Celsius in eine große Petrischale. Richten Sie ein Sezieren von Mikroskop und Mikroinjektor über einem Kühltisch ein.
Nach dem Ziehen von Glaskapillaren an eine feine Spitze die Kapillarnadel in den Mikroinjektor geben und die Nadelspitze mit Zangen brechen. Dann spülen Sie die Nadel durch Das Auf- und Austreiben von nuklease freies Wasser dreimal. Beachten Sie, dass die Öffnungsgrößen der Glasnadel zwischen Mücken und Hausfliegen variieren.
Als nächstes bereiten Sie eine Injektionslösung mit einer angemessenen Konzentration für Mücken vor. Fügen Sie drei Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine B zur Lösung hinzu, um die Visualisierung zu unterstützen. Verwenden Sie eine Pipette, um drei bis vier Mikroliter Lösung auf eine saubere Oberfläche zu übertragen, und ziehen Sie sie in die Glasnadel, ohne Luft aufzunehmen.
Drücken Sie den Injektionsknopf wiederholt, bis die Flüssigkeit beginnt, von der Nadel zu spenden. Verwenden Sie einen ultrafeinen Punktmarker, um Hash-Markierungen etwa einen Millimeter voneinander entfernt zu zeichnen, beginnend mit dem flüssigen Meniskus bis zum Nadelschaft. Stellen Sie die Rutsche der Mücken unter die Nadel und stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld breit genug ist, um die Lösung Meniskus in der Nadel zu sehen.
Richten Sie die Nadel mit dem mittleren Drittel des mesocarape Brustbeins aus. Die Mücke mit einer Zange auf der gegenüberliegenden Seite der Mücke gegen die Nadel stellen und die Nagelhaut mit der Nadelspitze sanft durchstechen. Schieben Sie die Nadel vorsichtig in die Mücke, bis die Spitze durch die Mittellinie gegangen ist.
Drücken Sie die Injektionstaste, bis die gewünschte Menge an Flüssigkeit injiziert wurde. Wenn sich der Meniskus nicht bewegt, schieben Sie die Mücke langsam oder fliegen Sie von der Nadel, während Sie auf Dieiskusbewegungen achten. Wenn ein Teil der injizierten Lösung Perlen aus der Nagelhaut bei der Nadelentfernung, oder wenn der Meniskus nicht bewegen, entsorgen Sie das Insekt, da die Injektion nicht erfolgreich war.
Auf der Hausfliege, richten Sie die Nadel mit dem Mesopleuron aus. Ziehen Sie die Fliege gegen die Nadel mit Zangen auf der gegenüberliegenden Seite der Fliege platziert, und sanft punktieren Sie die Nagelhaut mit der Nadelspitze. Übertragen Sie die injizierten Insekten, um 3,5 Unzen haltende Tassen in Gruppen von zehn bis 15 zu löschen.
Dann bedecken Sie die Tasse mit Netzen, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erholen. Nachdem sich die Insekten erholt haben, kehren Sie den Haltebecher über eine in 10%Saccharose-Lösung getränkte Baumwollkugel um. Füllen Sie zunächst eine 12 Zoll künstliche Membran mit frischem Blut und erhitzen Sie sie in einem Warmwasserbad auf 60 Grad Celsius.
Trocknen Sie die Membran mit einem Papiertuch und legen Sie sie über die Netzkappe des Halterbechers. Nachdem die Mücken gefüttert haben, ersetzen Sie den Baumwollball und lassen Sie die Mücken 24 Stunden ruhen. Als nächstes konstruieren Sie Ovipositionsbecher, indem Sie klare 3,5 Unzen Bioacetat-Becher mit etwa 30 Millimeteren entionisiertem Wasser füllen.
Legen Sie dann ein Stück Samenkeimpapier an den Boden der Tasse. Bedecken Sie den Becher mit Netzen, und schneiden Sie einen kleinen Schlitz in der Netzkappe. 24 Stunden nach der Fütterung einen kleinen Schlitz in die Kappe des Haltebechers schneiden und die Weibchen, die erfolgreich zu den Ovipositionsbechern gefüttert wurden, übertragen.
Dann versiegeln Sie den kleinen Schlitz in der Eileiterkappe mit einer 10%sucrose gesättigten Baumwollkugel. Überwachen Sie die Mücken und verfolgen Sie die tägliche Sterblichkeit. Nachdem die Mücken fünf bis sieben Tage lang oviposit, zählen Sie die Eier unter einem Sezieren Mikroskop.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Christopher Geden, einem USDA ARS Research Entomologist. Drei Tage nach der Injektion die Fliegen mit Kohlendioxid befeuchten. Dann übertragen Sie die Fliegen in einen sauberen Käfig mit Wasser und vorbereitete Fliegendiät.
Erfassen Sie die Sterblichkeitsdaten und entfernen Sie täglich tote Fliegen. Als nächstes mischen Sie 75% Weizenkleie mit 25% pelletiertem Lebendfutter nach Gewicht, um das Larvenzuchtmedium vorzubereiten. Fügen Sie Wasser in die Mischung, bis 62% Feuchtigkeit erreicht ist.
Fügen Sie die befeuchtete Weizenkleie Live-Stock-Futter-Mischung zu einem Quadrat von schwarzem Tuch, und rollen Sie es in eine Kugel. Verwenden Sie ein Gummiband, um das Tuch an Ort und Stelle zu halten, und drücken Sie sanft, bis das flüssige Medium durchsickert. Legen Sie den Ball in eine 60-Milliliter-Tasse und legen Sie ihn fünf Stunden lang in den Fliegenkäfig.
Danach spülen Sie die Eier vom Ball ab, um sicherzustellen, dass die Eier unter den Falten des Tuchs entfernt werden. Schütteln Sie die Eier, um alle Cluster zu stören, und übertragen Sie sie in ein abgestuftes 20 Milliliter Zentrifugenrohr. Lassen Sie die Eier absetzen, und notieren Sie das Volumen der sesse Eier in der Röhre.
Dann fügen Sie genügend Wasser hinzu, um das Volumen auf das 20-fache des Volumens der abgelegten Eier zu bringen. Als nächstes verwenden Sie eine magnetische Rührstange, um das Wasser und die Eisuspension zu mischen. Verwenden Sie schließlich eine modifizierte Pipettenspitze, um 0,5 Milliliter der Suspension auf ein Stück vorbefeuchtetes schwarzes Tuch in einer Reihe von Linien zu verteilen.
In diesem Protokoll wurden weibliche Mücken mikroinjiziert, um die Genexpression zu bewerten. Die Injektion von Weibchen mit Doppelstrang-RNA zeigte eine signifikante Reduktion der relativen Expression über mehrere Ovipositionszyklen hinweg. Die durchschnittlichen Kupplungsgrößen bei Mücken im ersten gonotrophen Zyklus wurden sowohl für dsRPS6 als auch für dsRPL26 behandelte Gruppen signifikant reduziert.
Ein offensichtlicher Dosiseffekt wurde bei der Injektion von dsRPS6 von einem Mikrogramm auf 50 Nanogramm bei weiblichen Mücken beobachtet. Hausfliegen wurden auch mit fünf Mikrogramm Doppelstrang-RNA-Konstrukte injiziert. Ähnlich wie bei den Mückenbeobachtungen wurde eine signifikante Verringerung sowohl der spezifischen Transkriptexpression als auch der Kupplungsgröße festgestellt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Insekten zu entsorgen, die nicht erfolgreich injiziert wurden. Mit diesem Verfahren kann jedes Doppelstrang-RNA-Konstrukt oder eine andere Biorationalisierung an Mücken oder Fliegen geliefert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Glasnadeln gefährlich sein kann, und sie sollten immer in entsprechenden scharfen Abfallbehältern entsorgt werden.
