Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der dreidimensionalen Struktur von Sehr großen menschlichen auf Maus Fettgewebe Ballettmikroskopie. Erleichterung der Verbindung von pathologischer Dysfunktion mit Fettgewebe strukturelle Veränderungen. Dieser Clearing-Prozess ist sehr einfach, sehr gut geeignet, um menschliche auf warmen Mäusen Fettgewebe zu löschen und weniger toxische Lösungsmittel wie Ethanol oder Methylsalicylat im Vergleich zu anderen klaren Protokollen verwenden.
Beginnen Sie damit, die geerntete Maus oder das menschliche weiße Fettgewebe in mindestens 10 Milliliter 4%Leistungsformaldehyd in PBS in einem 15 Milliliter Kunststoffrohr bevorzugt unter einer chemischen Haube einzutauchen. Schütteln Sie das Gewebe auf einer Rollplatte bei Raumtemperatur für eine Stunde, bevor Sie das Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius auf eine Rollplatte übertragen. Am nächsten Morgen spülen Sie das feste weiße Fettgewebe in 10 Milliliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur ab, um alle Spuren von Fixiermittel zu entfernen und das Gewebe in ein 15 Milliliter-Rohr mit 10 Millilitern 0,3%Glycin in PBS für eine eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker bei 100 Umdrehungen pro Minute zu übertragen.
Wenn die verbleibenden freien Aldehydgruppen abgeschreckt wurden, tauchen Sie das Gewebe in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Millilitern 0,2%Triton X-100 in PBS für eine zweistündige Inkubation mit Schütteln bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation behandeln Sie das Gewebe mit 10 Millilitern von 0,2%Triton X-100 und 20%DMSO mit Schütteln bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen tauchen Sie das Gewebe in ein 15 Milliliter Kunststoffrohr mit 10 Milliliter n.20, 0,1% Triton X-100, 0,1% Desoxycholat und 20% DMSO in PBS für eine mindestens 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius schütteln.
Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gewebe mit 10 Millilitern 0,2%Triton X-100 in PBS auf einem Orbitalshaker bei 100 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde. Gefolgt von eintauchen in 15 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln. Zur Färbung des weißen Fettgewebes.
Übertragen Sie das Gewebe in 300 Mikroliter 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS, ergänzt mit den primären Antikörpern von Interesse in einem 1,5 Milliliter Mikrorohr schützen es vor Licht mit Aluminiumfolie und legen Sie das Rohr in eine 50 Milliliter Falcon Tube. Legen Sie die Röhre in den Orbital-Shaker für eine zweitägige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln. Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gewebe zweimal in 10 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Schutz vor Licht.
Nach der zweiten Spülung waschen Sie das Gewebe in 10 Milliliter frische 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA und PBS für 16 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, dann das Gewebe in ein 1,5 Milliliter Rohr mit 300 Mikrolitern 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA in PBS übertragen, ergänzt mit den entsprechenden Sekundärantikörpern und schützen das Röhrenlicht mit Aluminiumfolie vor Licht. Nach einer zweitägigen Inkubation bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker, waschen Sie das Gewebe zweimal in 10 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA in PBS für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln vor Licht geschützt. Nach der zweiten Wäsche spülen Sie das Gewebe in ein Rohr mit 10 Millilitern frisch0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für 16 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Lichtschutz.
Gefolgt von einer zweistündigen Wäsche in 10 Milliliter PBS allein bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Lichtschutz. Für weißes Fettgewebe Clearing am Ende der PBS-Waschanlage tauchen Sie das Gewebe und 10 Milliliter einer aufsteigenden Ethanol-Konzentrationsserie für eine zweistündige Inkubation pro Konzentration bei Raumtemperatur mit lichtgeschütztem Schütteln ein. Am nächsten Morgen tauchen Sie das Gewebe in eine 20-Milliliter-Glasflasche mit einer Plastikkappe ein, die fünf Milliliter Methylsalicylat in einer Dunstabzugshaube enthält.
Das weiße Fettgewebe ist in diesem Stadium noch deutlich sichtbar. Schütteln Sie den Behälter mindestens zwei Stunden lang vor Licht bei Raumtemperatur. Das weiße Fettgewebe wird vollständig transplantiert.
Für die konfokale 3D-Bildgebung des gebeizten und gereinigten weißen Fettgewebes befestigen Sie eine metallische Bildgebungskammer, die mit einem Glasboden ausgestattet ist und in einer Dunstabzugshaube das Gewebe in die Kammer überträgt. Füllen Sie die Kammer mit frischem Methylsalicylat. Schließen Sie die Montage der Kammer durch Hinzufügen eines kleinen Abdeckungsschlupfes, um das Gewebe zu stabilisieren, und eines großen Abdeckungsschlupfes, um die Kammer zu schließen.
Legen Sie die Kammer auf eine invertierte konfokale Mikroskopstufe für die Gewebebildgebung bei geringer Vergrößerung, um einige Kubikzentimeter 3D-Karten der gesamten Fettgewebeprobe zu erzeugen. Verwenden Sie nach der 3D-Kartengenerierung ein 20-fache Seweitemluftobjektiv, das ein gutes Verhältnis zwischen Auflösung und Tiefe bietet, um mehrere Bereiche für die Gewebeprobenahme bei höherer Vergrößerung auszuwählen. Für die Zellsegmentierung konvertieren Sie 3D-Stacks in das Softwareformat, um Speicherplatz freizugeben.
Vor dem Öffnen des Zellenmoduls der Software. Ändern Sie die Zelldetektionseinstellung in Plasmamembranfärbung, und wählen Sie den Fluoreszenzkanal des Markers aus, der zur Abgrenzung der Zellperipherie verwendet wird. Richten Sie dann die Schwellenwerte ein, stellen Sie einen Bereich der erwarteten Zellengrößen bereit, und führen Sie die Segmentierung aus.
Die Auswirkungen der Reinigung auf das weiße Fettgewebe von Mensch und Maus können mit bloßem Auge beobachtet werden. Clearing verbessert auch die Bildtiefe des Gewebes, das erfasst werden kann, drastisch. Und erleichtert die Erstellung von 3D-Bildgebung und 3D-Kartengenerierung aus 4X Vergrößerung.
Die 3D-Mapping-Zuordnung ermöglicht es ferner, die Auswahl verschiedener Interessengebiete bei einer 20-fachen Vergrößerung bis zu einer Tiefe von zwei Millimetern zu erwerben. Spezifische Färbung von Lipidtröpfchen und Adipozyten kann mit Perilipin bzw. Anti-GLUT4-Antikörpern erreicht werden. Blutgefäße können entweder mit CD31-Antikörper oder intravenöser Injektion von Lectin DyLight 649 kurz vor dem Opfer nachgewiesen werden.
Makrophagen und T-Zellen können mit Anti-CD301-Phycoerythrin-Antikörpern und Anti-TCR-Beta-Pazifik-Blau-Antikörpervisualisiert werden. Das periphere Nervennetz kann mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper nachgewiesen werden. Anhand dieser Kennzeichnungen können dann die mittlere Größe und Größenverteilung der Adipozyten und die Dichte des Blutgefäßnetzes im Fettgewebe bestimmt werden.
Es ist wichtig, die Besatzungszeit zu befolgen, wie gezeigt, da eine schlechte Probenvorbereitung nicht zu einer guten Bildqualität führt. Dieses Protokoll kann mit einem fortschrittlichen Bildgebungssystem kombiniert oder mit der nachbearbeitungder Bildanalyse-Freeware gekoppelt werden.
