Name: localization, identification, and excision of murine adipose depots
Uploaded: 2014-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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The authors have no acknowledgements.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of Cincinnati und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung durchgeführt . 85-23, Revised 1996). 1. Euthanize und Sterilisieren der Maus <ol><li> Platzieren Sie die Maus in eine Dropbox gemacht, die einen supratheraputic Dosis von Isofluran und lassen Sie den Effekt zu inhalieren. Sobald die Maus getötet, aus dem Feld zu entfernen. </li><li> Zervikal als ein zweites Mittel der Euthanasie verrücken. </li><li> Sterilisieren der Außenfläche der Maus durch Reinigen des Tieres mit 70% Ethanol. </li></ol> 2. Identifizierung und Isolierung von drei verschiedenen Fettgewebedepots <ol><li> Braunes Fettgewebe (BAT) Isolation: <ol><li> Stellen Sie sicher, das Fell nass vom Alkohol Reinigung in Durchschneiden der epidermale und dermale laye Hilfers. </li><li> Bewegen Sie die Maus in Rückenlage mit dem Rücken gegen den Tisch. </li><li> Besorgen Sie sich die Haut direkt unterhalb der Membran mit einer Pinzette, Aufzug und mit einer Schere einschneiden. </li><li> Schneiden in Querrichtung um den Umfang der Maus, um das Peritoneum aussetzen. </li><li> Zeigen die schmetterlingsförmige BAT Depot von degloving die obere Hälfte der Maus. Die unteren Fortsätzen und Bauch in einer Hand und ziehen Sie die Haut bis zum Kopf. </li><li> Richten Sie die Maus, so dass es anfällig auf dem Tisch positioniert ist. Achten Sie darauf, um die freiliegende Depot mit Haar verunreinigen. </li><li> Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe. </li><li> Suchen Sie die Schulterblätter und entsprechende Depot. Entfernen Sie vorsichtig jede oberflächliche weiße Fettgewebe oben auf dem Schmetterling und sezieren den Schmetterling von interskapulären braune Fett. Seien Sie vorsichtig, um den Muskel eng mit der braune Fett assoziiert zu vermeiden. HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop wird zur Entfernung des w empfohlenhite Fettgewebe sowie bei der Trennung von dem braunen Fettgewebe von den Schulterblättern. </li><li> Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zu einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt. </li></ol></li><li> Isolierung von Unterhautfettgewebe (SQ), einem weißen Fettgewebe Depot (WAT): <ol><li> Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots. </li><li> Zeigen die Leisten, dreieckig SQ Depots de Behandschuhung die untere Hälfte der Maus. Halten Sie die oberen Fortsätzen und Thorax in einer Hand und ziehen Sie die Haut nach unten in Richtung der Füße mit der anderen Hand. </li><li> Richten Sie die Maus in Rückenlage, während man aufpassen, nicht, um den belichteten Depot mit Haar verunreinigen. </li><li> Saubere surgical Instrumente und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe. </li><li> Sorgfältig sezieren die Dreiecke der SQ Fett. Achten Sie darauf, die Probe mit Muskel verschmutzen, benachbarte Fett, Milchdrüsen oder indem alle Gefäße und verunreinigen die Probe mit Blut. HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop empfiehlt sich, wenn die Grenzen sind nicht klar definiert. </li><li> Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zum 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. </li><li> Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt. </li></ol></li><li> Isolierung von Keimdrüsenfett eine viszerale Fettgewebe (VAT) und weißen Fettgewebe (WAT) Depot: <ol><li> Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots. </li><li> Mit Scissors, schneiden Sie das Bauchfell in Querrichtung, direkt unterhalb des Zwerchfells. Schneiden Sie das Bauchfell von der Membran auf den Mastdarm Mitte koronal Bauchorgane aussetzen. </li><li> Suchen Sie die Hoden oder Eierstöcke und identifizieren die angebracht weißen Fettgewebe, wie die Nebenhoden Fettgewebe bei Männern oder Gonaden Fettgewebe bei Frauen bekannt. </li><li> Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe </li><li> Sorgfältig sezieren sowohl Nebenhodenfettdepots aus dem Hoden, Nebenhoden und Samenleiter. Oder wenn weiblich, sorgfältig sezieren beide Gonaden Fettpolster aus den Eierstöcken. </li><li> Entfernen Sie Fettdepots und sie auf 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. </li><li> Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt. </li&gt; </ol></li></ol> 3. Isolierung Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt) <ol><li> Die Isolierung des Herzens: <ol><li> Legen Sie die Maus in Rückenlage mit oberen und unteren Fortsätze nach außen erweitert. </li><li> Sichere Anhängsel mit chirurgischen Band. </li><li> Nach dem Positionieren der Maus wie oben aufgeführt, zu schaffen Spannung durch Anheben des Schwertfortsatz mit einer Pinzette. Horizontal geschnitten durch die Membran, Aussetzen der untere Teil der Brusthöhle. </li><li> Gute Spannungsstabilität, durch Anheben des Schwertfortsatz, schneiden durch den Brustkorb superior in Richtung des Kopfes, nur an der Seite des Brustbeins. </li><li> Nehmen Sie den Brustkorb nur schlechter als die Schlüsselbein und schnitt entlang der unteren Länge des Schlüsselbeins heraus in Richtung der Achselhöhle in beide Richtungen. Die Brusthöhle und sein Inhalt (Herz, Lunge, etc.) sollte nun deutlich sichtbar sein. </li><li> Reinigen Sie die Brusthöhle von fremden Blut und Flüssigkeit durch den Gebrauch steriler gauze um die Flüssigkeit zu absorbieren. Wenn das Sammeln Organen oder Gefäßen achten Sie darauf, profuse (zusätzliche Informationen). </li><li> Sobald der Bereich des Fluid gelöscht, schneiden die Bronchien und Anbringen Gefäßen, um die Lungen zu entfernen, so dass eine bessere Belichtung des Herzens. </li></ol></li><li> Lokalisierung und Exzision Aortic Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt): <ol><li> Entfernen Sie die folgenden Organe besser zu identifizieren, die dem unteren Bereich der Hauptschlagader: Leber, Magen, Milz, Pankreas, Darm und Dickdarm. </li><li> Starten Sie zunächst mit der Identifizierung des Magens und der Speiseröhre. Schneiden Sie die Speiseröhre in den Magen-und Speiseröhrenkrebs Kreuzung, um den Magen aus dem Körper zu befreien. </li><li> Als nächstes identifiziert den Darm und die umliegende Gekröse. Schneiden Sie oberflächlich durch Gekröse, da es sehr eng mit dem Nieren Teil der Aorta liegt, dann &quot;führen Sie den Darm.&quot; </li><li> Schneiden Sie den Doppelpunkt zu befreien so nah an den Mastdarm wie möglich. Somit befreit den Magen, Darm und Dickdarm von der Maus. </li><li> Rebewegen Sie den Magen, Darm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse und Milz durch Schneiden durch die Befestigungs Gekröse und Gefäße. Die Bauchspeicheldrüse und Milz sollte mit dem Magen, Darm und Dickdarm Tarif. </li><li> Entfernen Sie die Leber durch Schneiden durch die Lebervenen und Anbringen Gekröse, entfernen Sie alle Lappen. </li><li> Schneiden Sie die viszerale Fettschicht und umgeben die Nieren. Lassen Sie die Nieren in die Aorta in vivo angebracht ist, als geografische Marker für verschiedene Segmente der Aorta zu dienen. </li><li> Spülen Sie den Bereich mit sterilen 1x PBS und entfernen Sie alle Flüssigkeit durch Absorption mit steriler Gaze. </li><li> Mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzette, trennen Sie die Hauptschlagader von seinem Rücken-an der Wirbelsäule und ihrer ventralen Befestigung an der Speiseröhre. </li><li> Isolieren Sie die Aorta, indem Sie und Lösen der Aorta die Länge der absteigenden Aorta vom Ursprung im Herzen zur Bifurkation in der Leistengegend. </li><li> Identifizieren und zu isolieren, die Schlüsselbeingefäßen. Trennen Sie diese Gerätevom Hals bis der Aortenwurzel, besser setzen die Aorten-Kreuzung und Wurzel im Herzen. </li><li> Entfernen Sie den Thymus dann schneiden die Truncus brachiocephalicus, die linke Halsschlagader und der linken Schlüsselbeinarterie, die eine Bewegung des Herzens. </li><li> Mit der Unterstützung von einem Dissektionsmikroskop, zeigen Sie die perivaskulären Fettgewebe (PVAt) Schicht rund um die Aorta. </li><li> Unter besonderer Berücksichtigung der nicht kneifen oder drücken Sie die PVAt, ziehen Sie den PVAt Weg aus der Aorta mit Mikro-Pinzette. Geschnitten sanft die Befestigung des PVAt zur Aorta mit Mikroscheren ab thorakalen Bereich genau oberhalb denen die Membran angeordnet ist. HINWEIS: Ein Dissektionsmikroskop empfohlen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang über die gesamte Länge der Aorta, und endet bei der infrarenalen Region, die sich nur überlegen die iliakalen Bifurkation der Aorta Gefäß. </li><li> Wenn Aortenbogen PVAt gewünscht wird, verwendet die gleiche Methode, um die PVAt vom wenigen c entfernenurvature des Bogens. </li><li> Platzieren PVAt Proben in 2 ml Mikrozentrifugenrohr (en). </li><li> Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt. HINWEIS: Weitere Fettgewebe Depots bei Interesse an einer umfassenden Fettgewebe Depotanalyse berücksichtigen: retroperitoneal, mesenterialen, omentalis, Herzbeutel und Kniekehle. </li></ol></li></ol>

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	<li>Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+obesity+in+the+United+States,+2009-2010.">Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010.</a> NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).</li><li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. 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The authors declare that they have no competing financial interests or other conflicts of interest.

Übergewicht kann zu einer großen Vielzahl von Begleiterkrankungen und dem vollen Verständnis der Rolle, die adipöse spielt ist nicht vollständig geklärt führen; daher die weitere Forschung auf dem Gebiet der adipösen notwendig. Tiermodelle, insbesondere murine Modelle sind ideal für Vorlaufforschung in der Progression von Krankheiten und das Testen von potentiellen pharmazeutischen Behandlungen. Bei der Verwendung dieser Modelle ist eine genaue Trennung und Entfernung von Fettgewebedepots ein äußerst wichtige...

Adipöse einen bemerkenswerten Auftritt im Scheinwerferlicht der Medien, durch dramatische Zunahme Adipositas ist in den letzten Jahrzehnten des 20. Jahrhunderts. Übergewicht wirkt sich auf derzeit mehr als ein Drittel der Erwachsenen und 17% der Kinder und Jugendlichen in den Vereinigten Staaten (US) 1. Quer durch alle ethnischen Gruppen hat statistische Untersuchungen rund um die Adipositas-Epidemie gezeigt, dass nicht-hispanischen Schwarzen haben die höchste altersbereinigte Rate von Übergewicht (49,5%) im Vergleich zu Mexico-Amerikaner (40,4%) aller Hispanics (39,1%), und nicht- hispanischen Weißen (34,3%) 2. Die wirtschaftlichen Auswirkungen von Übergewicht ist auch ein wachsendes Interesse für das Gesundheitssystem. Im Jahr 2012 wurde geschätzt, dass die jährlichen medizinischen Kosten für die Betreuung von Fettleibigkeit in den USA im Jahr 2005 190.200.000.000 $, fast 21% der gesamten medizinischen Ausgaben Budget. Leider wurde die Fettleibigkeit bei Kindern geschätzt 14 Milliarden Dollar im direkten medizinischen Kosten allein verantwortlich zu sein. Statistisch gesehen, war es, dass die durchschnittliche medizinische Kosten ermitteltPersonen mit Übergewicht war 2741 $ pro Jahr höher als die ohne diese Morbidität 3-5. Übergewicht ist ein wichtiger Risikofaktor für eine Vielzahl von Erkrankungen wie: Typ 2-Diabetes, Fettstoffwechselstörungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Muskel-Skelett-Erkrankungen und chronischen Entzündungen. Adipositas ist tief mit der Pathogenese von metabolischen Syndrom und anderen chronischen Erkrankungen 6-8 gebunden. Mit solch drastische und negative Zusammenhänge zwischen Adipositas und anderen Begleiterkrankungen, hat die wissenschaftliche Forschung konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf die aktuelle Epidemie und die vielfältigen und eine entscheidende Rolle gespielt von Fettgewebe besser zu verstehen. Historisch wurde Fettgewebe als belanglos und wurde nur als eine einfache Befüllung Gewebe angesehen. Derzeit Fettgewebe wurde gezeigt, dass viele wichtige Rollen in der Körper die Funktion spielen: Stoffwechsel, Hormonhaushalt, Entzündungen, Schutz und Isolierung 9. Fettgewebe ist in erster Linie ausAdipocyten enthält aber auch Perizyten, Endothelzellen, Monozyten, Makrophagen und pluripotenten Stammzellen 8. Fettgewebe wird durch den Körper in unterschiedlichen Depots verteilt. Die Hauptdepots können subdermal gefunden werden, subkutan, intramuskulär und viscerally 10. Adipose Depots gezeigt worden, Depot spezifische Stoffprofile, die eine Depot spezifische Anfälligkeit für Fettleibigkeit gezeigt und verwandten Störungen 8 haben. Traditionell wurde Fettgewebe in zwei Haupttypen klassifiziert: weißes Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT); obwohl neuere Literatur zeigt die Präsenz einer dritten Gruppe getauft brite oder beige Fettgewebe 11. Fettgewebe ist gezeigt worden, um verschiedene Farben zu Morphologien, die Stoffwechselfunktionen, biochemischen Eigenschaften und die genetische Expressionsmuster 10 aufweisen. Adipozyten in WAT ein einziges, großes Fetttröpfchen und variable Mengen von Mitochondrien. WATdominant im subkutanen und viszeralen Ortschaften des Körpers gefunden. WAT wirkt in erster Linie als Ort der Energiespeicherung und Organprotektion. Adipozyten in BAT eine multilokuläre Morphologie und reichlich Mitochondrien. BAT ist in erster Linie in den Hals und großen Blutgefäße des Thorax, sowie die Schulterblätter 12 angeordnet. BAT vor allem Funktionen in energie aufwendet Verhaltensweisen, die Thermogenese 7 regulieren. Brite oder beige Fettgewebe wurde gezeigt, dass eine analoge Morphologie und Expression BAT teilen, aber hat sich herausgestellt, von weißen Fettzellen 11 entstanden ist. Die beschriebene Operationsmethode in diesem Manuskript bietet Forschern mit der Fähigkeit, verschiedene Effekte, dass Faktoren wie zu analysieren: Umwelt, Pharmazie und Genetik, haben am Fettgewebe; sowie die vorteilhafte oder nachteilige Rolle spielt in adipose Erkrankungen und allgemeine Gesundheit. Auch bietet eine Möglichkeit zur Identifizierung und Isolierung verschiedener Arten von Fettgewebeermöglichen ein besseres Verständnis der biochemischen Zusammenhänge und Unterschiede zwischen Depots. Dies kann bei der Bestimmung der Beziehung zwischen der Lage, die Funktion und Arten von Fett im Körper zu unterstützen. Das beschriebene Verfahren erreicht dies, indem sie die Einrichtung zum Brutto Visualisierung, Genexpressionsanalyse, Analyse der Proteinexpression, die histologische Untersuchung und Isolierung von primären Zelllinien für die in vitro-Studien. Momentan gibt es viele Artikel, die einen Einblick in die metabolischen Verhalten verschiedener adipose Depots sowie ihre anatomischen Orten bereitzustellen; aber nicht bieten eine gründliche Methode, wie man gezielt zu lokalisieren, identifizieren und isolieren diese Depots. Dieses chirurgische Verfahren liefert eine genaue Technik, die für die Isolierung von mehreren Depots mit einer minimalen Menge an Präparation und Verunreinigungen im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolat von einem oder zwei Depots 13-14 gestaltet ermöglicht. Das Ziel des Protokolls ist es,ein präzises Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von verschiedenen Arten von Fettdepots von mehreren anatomischen Stellen.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>#RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher</td><td>07-678-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEF-12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-6421</td><td>Warm in waterbath before putting on tissue.</td></tr><tr><td>2 ml Microcentrifuge tubes</td><td>Midsci</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr></tbody></table>

localization, identification, and excision of murine adipose depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Identifizierung und Lokalisierung von Leisten subkutane Fettgewebe, interskapulären braunen Fettgewebe, viszerale Fettgewebe Nebenhoden (Abbildung 1) sowie den Aortenbogen perivaskulären Fettgewebe, thorakalen Aorta Fettgewebe, Neben Aorta Fettgewebe und der infrarenalen Fettgewebe (Abbildung 2) wurde erfolgreich mit Hilfe erreicht die beschriebene Operationsmethode. Die histologische Untersuchung und Differenzierung zwischen BAT und WAT Proben wurden positiv mit Hämatoxylin und Eosi...

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Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

localization-identification-and-excision-of-murine-adipose-depots

Research

JoVE Journal

Medicine

41.0K Aufrufe.  University of Cincinnati College of Medicine.  Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren. 

Serie: Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Biotechnik

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Immunologie und Infektion

Lymphatic and Blood Network Analysis During Obesity

Lymphatic collecting vessels and lymph nodes are inevitably embedded in adipose tissue. The physiological significance of this observation remains still not elucidated. However, obesity is characterized by impaired lymphatic function and increased vessel permeability. Inversely, lymphatic dysfunction induces obesity in mice, suggesting a significant interplay between lymphatic vessels and the adipose tissue. Therefore, understanding factors leading to lymphatic dysfunction might open new therapeutic windows to prevent obesity and associated comorbidities. The first step in this process requires a precise and detailed visualization of the lymphatic network in healthy and inflamed adipose tissue. Here, we describe a rapid, inexpensive, and efficient method that allows to label and analyze lymphatic and blood vessels. This approach takes advantage of the skin-draining brachial lymph node localization within the subcutaneous adipose tissue. The lymphatic arborization of this tissue can be revealed by injecting fluorochrome-conjugated lectins subcutaneously. Moreover, the in vivo labeling approach provides a way to evaluate lymphatic vessel density and functions. Coupled to blood vessel, adipocyte and immune cell staining, the protocol allows for high-resolution mapping of the subcutaneous adipose tissue by 3D imaging.

Obesity is a growing global public health issue. It has been previously associated with lymphatic dysfunction, suggesting a vital crosstalk between the adipose tissue and the lymphatic system. Here, we propose an accessible methodology allowing the distinct labeling of blood and lymphatic vasculatures within the subcutaneous adipose tissue.

Lymphatic collecting vessels and lymph nodes are inevitably embedded in adipose tissue. The physiological significance of this observation remains still ...

Medizin

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Biologie

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Isolierung und Identifizierung vaskulärer Endothelzellen aus unterschiedlichen Fettdepots für Downstream-Anwendungen

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Halbautomatische Isolierung von weißem Fettgewebe der Maus

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor im Rampenlicht: Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus weißem Fettgewebe der Maus mit einem Gewebedissoziator  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Morphologische und molekulare Charakterisierung der scBAT bei Mäusen

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly impacted by environmental stimuli in mice and humans. Currently, murine interscapular BAT (iBAT), which is located between two scapulae in the upper dorsal flank of mice, is the main BAT depot used by research laboratories to study BAT function. Recently, a few previously unknown BAT depots were identified in mice, including one analogous to human supraclavicular brown adipose tissue. Unlike iBAT, murine supraclavicular brown adipose tissue (scBAT) is situated in the intermediate layer of the neck and thus cannot be accessed as readily.
To facilitate the study of newly identified mouse scBAT, presented herein is a protocol detailing the steps to dissect intact scBAT from postnatal and adult mice. Due to scBAT&#39;s small size relative to other adipose depots, procedures have been modified and optimized specifically for processing scBAT. Among these modifications is the use of a dissecting microscope during tissue collection to increase the precision and homogenization of frozen scBAT samples to raise the efficiency of subsequent qPCR analysis. With these optimizations, the identification of, morphological appearance of, and molecular characterization of the scBAT can be determined in mice.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Extraktion von supraklavikulärem braunem Fettgewebe für die genetische Analyse

Here, we provide a practical procedure for dissecting and performing histological and gene expression analyses of murine supraclavicular brown adipose tissue.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Lymphatic and Blood Network Analysis During Obesity

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Isolierung und Identifizierung vaskulärer Endothelzellen aus unterschiedlichen Fettdepots für Downstream-Anwendungen

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe