Jüngste Studien haben die entscheidende Rolle der Angiogenese und sympathischen Innovation bei der Umgestaltung von Adipose-Gewebewährend während der Entwicklung von Fettleibigkeit hervorgehoben. Hier zeigen wir eine modifizierte Immunfluoreszenzmethode, die Blutgefäße und Nervenfasern effizient im Adipose-Gewebe abhält. Unser Ansatz ist geradlinig und effizient, ohne Kompromisse bei der Standeffizienz und der Qualität.
Wir erfassen die Bilder mittels konfokaler Mikroskopie. Die hohe Auflösung der Bilder ermöglicht es uns, die Blutgefäßnetze zu rekonstruieren und ihre Eigenschaften genau zu analysieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit Anästhesie und Perfusion von sechs Wochen C57 Black-6J männlichen Mäusen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Sezieren Sie weiße und braune Fettprobleme von den Mäusen. Verwenden Sie eine Schere, um die Gewebeproben in kleine Stücke von Stücken zu brechen. Übertragen Sie die kleinen Brocken mit der sterilisierten Pinzette in die Gewebeeinbettungskassetten mit entsprechender Beschriftung der Gewebeproben auf den Kassetten.
Tauchen Sie die eingebetteten Kassetten mit Gewebeproben bei vier Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden in die Fixierlösung ein. Übertragen Sie die kleinen Stücke wurde sterilisiert Pinzette in eine Petrischale. Waschen Sie die Proben 3 mal mit Bürste 1x PBS Puffer bei 0,5 Milliliter pro Waschgang.
Nun schneiden Sie die festen Gewebeproben mit der sterilisierten Schere in etwa zwei Kubikmillimeter-Würfel. Zur Permeabalisierung die Proben in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit einem Milliliter 1%Triton PBS Puffer übertragen und die Rohre bei Raumtemperatur 1 Stunde bei 18 U/min vorsichtig drehen. Nach einer Stunde entfernen Sie vorsichtig den 1%Triton PBS Puffer, indem Sie die Proben dreimal abwaschen, indem Sie die 1x PBS direkt in die gleichen Rohre einbauen.
Bei jeder Wäsche die Rohre mehrmals umkehren. Zum Blockieren 0,5 Milliliter Sperrpuffer zu den Proben und Inkubator bei Raumtemperatur für zwei Stunden mit sanfter Rotation hinzufügen. Um 0,4 Milliliter Primärantikörperlösung vorzubereiten, verdünnen Sie zwei Mikroliter Anti Endomusin und zwei Mikroliter Antityrosin-Hydroxylase-Antikörper bis zu 396 Mikroliter Sperrpuffer.
Wirbel und Spin-down, um das Volumen wiederherzustellen. Entfernen Sie nun vorsichtig den Sperrpuffer aus den Gewebestücken. 100 Mikroliter der vorbereiteten Primärantikörperlösung in Dier geben und bei vier Grad Celcius über Nacht brüten.
Sammeln Sie am nächsten Tag sorgfältig die primäre Antikörperlösung zur Wiederverwendung, falls gewünscht. Waschen Sie die Proben dreimal mit 1x PBST bei 500 Mikroliter pro Waschgang 30 Minuten mit sanfter Drehung bei 18 Umdrehungen. Zur Herstellung einer Sekundärantikörperlösung zwei Mikroliter Mehl-Flouro konjugiert Anti-Gott IGG in zwei Mikroliter Mehl-Flouro konjugiert Anti-rabiatig IGG in 396 Mikroliter Sperrpuffer verdünnen.
Wirbel und drehen Sie kurz, um die gesamte Flüssigkeit zu sammeln. Entfernen Sie nun den letzten Waschpuffer aus den Proben. Fügen Sie 100 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung in Dier hinzu.
Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für zwei Stunden mit sanfter Rotation bei 18 Umdrehungen bei 18 Umdrehungen. Nach sorgfältigem Entfernen der sekundären Antikörperlösung die Proben dreimal mit 1x PBST bei 500 Mikroliterpro Waschgang für jeweils 30 Minuten mit sanfter Drehung bei 18 Umdrehungen waschen. Für die optische Clearance tauchen Sie die Proben in einen Milliliter 90% Glycerol ein und halten Sie die Proben bei vier Grad Celcius in der Dunkelheit, bis sie transparent werden.
Fügen Sie hier einen Silizium-Isolator zum Dia hinzu, um einen Brunnen für die Volumenabbildung zu erstellen. Halten Sie die Höhe des Silikons auf oder etwas weniger als die der Probe. Übertragen Sie die Proben vorsichtig in den Brunnen und füllen Sie sie mit dem Montagemedium.
Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberfläche und versiegeln Sie die Viertel des Deckslips mit einem hochviskosen Medium. Lassen Sie das Montagemedium 24 Stunden bei Raumtemperatur und Dunkelheit aushärten. Nach Abschluss der Aushärtung die Kanten des Deckellipss für eine optimale Probenlebensdauer vollständig versiegeln.
Erfassen Sie Z-Stack-Bilder mit dem 20-fachen Ziel eines konfokalen Mikroskops und der entsprechenden Software. Starten Sie das System. Klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration und aktivieren Sie sowohl den Argon-Laser als auch den He-Ne 633-Laser.
Klicken Sie auf die Registerkarte "Acquire". Bewegen Sie im Bedienfeld der sichtbaren Laserlinien die entsprechenden Intensitätsschieber nach oben, um die Laserlinien bis 488 Nanometer und 633 Nanometer auszuwählen. Zunächst können die Intensitäten auf 20 bis 30% eingestellt werden Jetzt wählen Sie die 488, 561, 633 dreifache dichroitische Spiegel.
Aktivieren Sie die Fotomultiplikatoren, indem Sie auf die aktiven Kontrollkästchen klicken. Wählen Sie Photomultiplier 1 für die Emission des 488 Nanometer Lasers und Photomultipliers 34 für den 633 Nanometer Laser. Stellen Sie den Wellenlängenbereich für Fotomultiplikator 1 auf 500 bis 550 Nanometer ein.
In 650 bis 750 Nanometern, für Fotomultiplikator drei. Wählen Sie die Pseudofarbe aus, die für die Bildanzeige verwendet werden soll, indem Sie auf das farbige Rechteck neben jedem Fotomultiplikator doppelklicken und eine Farbe aus dem Popupmenü auswählen. Klicken Sie nun auf live, um das Bild an den Beispielen zu überprüfen.
Verwenden Sie den Z-Positions-Nob, um eine Fokusebene innerhalb des XY-Bereichs auszuwählen. Passen Sie die Helligkeit der Bilder an, indem Sie die Laserintensität, die intelligente Verstärkung und den Offset drehen. Führen Sie diese Einstellung für jeden Fluoreszenzkanal im Anzeigemodus der Schnellsuchtabelle durch.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnellauswahltabelle", um den Schnellsuchtabellenmodus zu wechseln, in dem gesättigte Pixel blau angezeigt werden, um die Einstellung der entsprechenden Helligkeitsstufe zu unterstützen. Klicken Sie zweimal auf die Schaltfläche "Schnellnachschlagstabelle", um zum Pseudo-Farbanzeigemodus zurückzukehren. Drehen Sie beim Scannen den Nob Z gegen den Uhrzeigersinn, um die Fokusebene an ein Ende des Interessensvolumens zu verschieben.
Klicken Sie dann auf die Endpfeilspitze, um den Scan vorgangund und die Position festzulegen. Drehen Sie die Z-Position im Uhrzeigersinn, um die Fokusebene durch die Probe an das andere Ende des Zinsvolumens zu bewegen. Klicken Sie dann auf die Startpfeilspitze, um die Startposition des Scannens festzulegen.
Passen Sie die Z-Schrittgröße auf drei Mikrometer an. Ändern Sie die Bildqualität, indem Sie ein Format von 1024 bis 1024, eine Geschwindigkeit von 100 Hz und einen Liniendurchschnitt von zwei auswählen. Wählen Sie Start aus, um die Z-Stack-Bildaufnahme zu initiieren Für die maximale Projektion des erworbenen Bildstapels klicken Sie auf die Registerkarte Prozess und dann tool;wählen Sie 3D-Projektion und geben Sie das Maximum in die Methodenliste ein, ohne Änderungen an X, Y und Z.Set-Schwellenwert auf Null, klicken Sie auf Anwenden.
Die maximale Intensität der Z-Lautstärke wird in ein 2D-Bild gestapelt, das angezeigt wird. Um die 2D-Bilder über Open-Source-Software zu analysieren, öffnen Sie die gestapelten Bilder in der Software. Passen Sie den Behälterdurchmesser und die Intensität an, bis alle Behälterstrukturen richtig ausgewählt werden können.
Wählen Sie die Ausführungsanalyse aus, und exportieren Sie die Daten gemäß den Anleitungen der Software. Um die 3D-Bilder über die Lizenzsoftware zu analysieren, öffnen Sie die Rohdaten von Bildern mit der Software. Passen Sie den Intensitätsschwellenwert und andere Parameter an, bis die Gefäßstrukturen in jeder Schicht des Z-Volumens richtig segmentiert sind.
Skelettieren Sie den resultierenden binarised Bildstapel, um ein spezielles Diagramm zu erhalten. Analysieren Sie die ausgewählten Segmentmerkmale und exportieren Sie die Daten gemäß der Anleitung der Software. Die distale Region epididymale weiße sumesiertes Fettgewebe, die mediale Region des dorsalen Lendensubkutanen weißen Fettgewebes und die mediale Region des intrakapulierlichen braunen Fettgewebes wurden gesammelt.
Nach einer ganzen Montagefärbung wurden die Gewebestämme montiert und mit dem konfokalen Mikroskop abgebildet. Mehr Blutgefäße wurden positiv befleckt. Mit dem Anti-Endomusin-Antikörper im inkubierten subkutanen weißen Fettgewebe inglycerin, was darauf hindeutet, dass der Clearingschritt für die vollständige Färbung der Blutgefäße entscheidend ist.
Um festzustellen, ob Blutgefäße und Nervenfasern unterschiedliche Muster unter den Depos mit dieser Methode aufweisen, wurde die gemeinschaftliche Fluoreszenzfärbung in Fettgewebe mit Antikörpern mit Anti-Endomusin durchgeführt, um Blutgefäße zu zeigen, und mit Antityrosin-Hydroxylase, um Nervenfasern zu zeigen. Interessanterweise zeigen die Ergebnisse, dass sie deutlich mehr Blutgefäße als Nervenfasern im braunen Fettgewebe im Vergleich zu weißem Fettgewebe waren. Unter dem weißen Fettgewebe zeigte das subkutane weiße Fettgewebe eine höhere Blutgefäßdichte als das epididymale weiße Fettgewebe.
Bemerkenswert ist, dass sich die Nervenfasern zwar parallel zu den Blutgefäßen ausdehnten, aber keine signifikante Kolokalisierung zeigten. Die Gefäßfläche, die Anzahl der Knoten und die Rohrlänge wurden dann mit der 2D-Methode in diesen drei Fettgewebearten qualitativ gemessen und fanden ähnliche Ergebnisse. Diese Methode kodiert effizient Blutgefäße und Nervenfasern und Fettgewebe.
Es klingt als nützliches Werkzeug für die Untersuchung der dynamischen Veränderung im Fettgewebe während der Entwicklung von Fettleibigkeit. Leistungsstarke Mund hy-de ist giftig. Bitte führen Sie P-ifa beteiligte Schritte in einem breiteren Hautkontakt und inhalieren und richtig behandeln die P-ifa Da die Laserstrahlen sind Fokalmikroskop geworden, aber schaden das Auge.
Vermeiden Sie die Augenexposition gegenüber den Strahlen, die vom Ziel
