Wir möchten alle Mitglieder der McMahon Labor für ihre Hilfe und Unterstützung danken. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus einem NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM) und eine institutionelle Forschungs-und Nachwuchsförderung Award (IRACDA JS) unterstützt.

1. Zubereitung ganzer Zellysate aus Zellkultur <ol><li> Zeigen Zellkulturschalen auf Eis und kaltes PBS mit 5 mM EDTA (z. B. 5 ml PBS mit 5 mM EDTA/10 cm 2 Schild). Entfernen anhaftender Zellen von der Schale mit einem Zellschaber und übertragen die Zellsuspension in einem kalten 15 ml konischen Röhrchen dann. </li><li> Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 1000 Upm (230 × g) für 5 min bei 4 ° C. Zeigen konische Röhrchen auf Eis und den Überstand vorsichtig absaugen, ohne dass der Pellets. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 1 ml PBS mit 5 mM EDTA und übertragen Zellsuspension zu einer kalten 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Schnell Spin Suspension bei 13.000 rpm (13.226 xg) für 10 sec Zellen zu pelletieren. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet und Ort Röhrchen auf Eis zu stören. </li><li> Das Pellet in 25-200 &amp;mgr; l (je nach Granulatgröße, dh 3 × 10 6 Zellen hinzuzufügen ~ 150 &amp;mgr; l RIPA-Puffer) inRIPA-Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% NP-40) mit frisch zugesetzten Protease-und Phosphatase-Inhibitoren bei einer Endkonzentration 2x. Kurz vortexen jedes Rohr Suspension und Inkubation für 20-30 min auf Eis. Hinweis: Es gibt mehrere Lyse-Puffer, die verwendet werden können, um Proteine ​​zu extrahieren, die in ihrer Fähigkeit, Proteine ​​und Stärke ihrer denaturierenden Detergens (z. B. SDS, Triton X-100 oder NP-40) zu solubilisieren abweichen. RIPA-Puffer ist zur Herstellung von ganzen Zelllysaten und stören Protein-Protein-Wechselwirkungen. </li><li> Um eine post-Kernfraktion, Zentrifuge Lysate bei 14.000 rpm (15.339 xg) für 5 min bei 4 ° C zu erstellen Den Überstand in ein neues Röhrchen, ohne die Kern angereicherten Pellets und Ort Röhrchen auf Eis zu stören. Hinweis: Die Kern angereicherte Pellet kann auch aus dem Rohr zu lösen, während das Extrahieren des Überstandes. Um das Sammeln der Kern angereicherten Pellets zu vermeiden, legen Sie die Pipettenspitze direkt into viskosen Kern angereicherten Pellets und ziehen Sie es mit der Pipette, um ihn zu entsorgen. </li><li> Bestimmen der Proteinkonzentration jeder Probe nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung solcher Proteinquantifizierungsassays als BCA-oder Bradford. </li></ol> 2. Probenvorbereitung und Elektrophorese <ol><li> Vorbereitung jeder Probe entsprechend der folgenden Übersicht zusammengestellt. Als Alternative können auch β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 2,5% verwendet werden. Jedoch sollte das Reduktionsmittel zu jeder Probe bis zu einer Stunde vor dem Laden des Gels zugesetzt werden. Das Gesamtvolumen Konten zum Pipettieren Varianten mit nur 20 ul jeder hergestellten Probe pro belastet auch. <table border="1"><tbody><tr><td> REAGENS </td><td> Reduzierten Probe </td></tr><tr><td> Proteinprobe </td><td> X ul </td></tr><tr><td> 4x LDS Sample Buffer </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> 500 nM DTT Reducing-Agent </td><td> 2,4 ul </td></tr><tr><td> VE-Wasser </td><td> Bis zu 15,6 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 24 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min. Während die Proben erhitzt, bereiten 1.000 ml 1x MES-oder MOPS-Laufpuffer (50 ml 20x MES-oder MOPS Laufpuffer und 950 ml VE-Wasser). MOPS-Laufpuffer löst mittelgroße Proteine ​​zwischen 14-200 kDa, während MES Laufpuffer löst geringeren Molekulargewicht zwischen Proteinen 2-200 kDa mit einem niedrigeren pKa, die die MES-Laufpuffer, um schneller als die MOPS 4 laufen zu lassen. Somit sind diese beiden Pufferspeicher haben gegenläufigen Effekten auf die Wanderung der Ionen im Sammelgel, die Unterschiede in der Trennung der Proteinbanden 4 führt. Beiseite stellen und kombinieren 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer mit 500 ul Antioxidationsmittel, die verwendet werden, um die obere Pufferkammer der Min füllen werdeni-Cell Elektrophorese-Einheit. </li><li> Sobald die Proben, bevor Sie sie auf Eis fertig Heizung, schnelle Runde Proben. </li><li> Für die Montage der Fertig Bis-Tris Gele in den Mini-Cell-Einheit für die Elektrophorese folgen den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jedes Gel wird in der Weise orientiert, dass die kürzeren (kleineren) Kassette jedes Gels Gesichter nach innen auf die Buffer-Core und die Gele sind eben und fest gegen den Buffer-Core gedrückt, um das Auslaufen aus dem oberen Pufferkammer zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie den oberen Pufferkammer mit den 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer, der die Antioxidationsmittel und der unteren Pufferkammer der Mini-Cell-Einheit mit ca. 600 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer. Die zusätzlichen 200 bis 300 ml Laufpuffer kann zur späteren Verwendung gespeichert werden. Es wird jedoch nicht empfohlen, den Puffer während der Elektrophorese Lauf verwendet, wie der pH-Wert und die Qualität des Puffers können geändert werden, zu recyceln. </li><li> Legen Sie 20 ul jedes Protein sample in jede Vertiefung. Wenn Schnitt die Membran in verschiedenen Streifen, um für mehrere Antikörper (dh mehr als 2) zu untersuchen, ist es dringend empfohlen, 2-5 ul der vorgefärbten Proteinstandard in der ersten und letzten Wells jeder Gel laden, da dies als zu dienen Schneidführungen für die Trennung der verschiedenen Abschnitte der Membran, ohne die Abbildungs ​​der Proteinbanden. </li><li> Gele laufen bei 200 V konstant 35 min mit einem erwarteten Strom von 110-125 mA / Gel zu Beginn und 70-80 mA pro Gel am Ende. Elektrophorese ist beendet, wenn die Tracking-Farbstoff wandert zu der Platindraht entlang der Buffer-Core. </li></ol> 3. Protein-Transfer mit den iBlot Dry Blotting-System <ol><li> Völlig trennen die Mini-Gele, die durch das Brechen der gebundenen Seiten der Kassette (das kann eine knisterndes Geräusch zu erzeugen). Entsorgen Sie den kürzeren (kleineren) Platte und das Gel sorgfältig übertragen von der längeren (Schlitz)-Platte in einen Behälter mit VE-Wasser undentfernen Sie die dicke tritt Teil des Gels auf der Unterseite. Hinweis: In seltenen Fällen kann das Gel auf die kürzere Platte statt der mehr zu befestigen, geschlitzte Platte. In diesem Fall verwerfen die längere, Schlitzplatte und die dicke tritt Teil des Gels an der Unterseite des Geräts entfernen. Anschließend vorsichtig mit dem Gel übertragen von der kürzeren Platte VE-Wasser. </li><li> Montieren die Anoden-und Kathodenübertragungsstapel nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: sowohl Nitrocellulose oder PVDF-Membranen bieten qualitativ hochwertige und effiziente Übertragung der Proteine ​​und sind mit Fluoreszenzdetektion 8 kompatibel. Jedoch PVDF-Membran hat eine höhere Bindungskapazität (240 &amp;mgr; g / cm 3) als Nitrocellulose 8 (200 &amp;mgr; g / cm 3). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig jegliche Blasen oder Luft zwischen dem Gel und Membran, wie diese gefangen wird jede Verzerrung der Proteinbanden während der Übertragung zu verhindern. Hinweis: nicht die Membran oder die transf trimmener stapeln, um Ihre Gel-Größe passen, da dies direkten Kontakt zwischen Anoden-und Kathoden Stacks führen. </li><li> Nach der korrekten Montage der Transfer-Stacks auf der Dry-Blotting-Gerät, wählen Sie die entsprechende Spannungsprogramms (dh Programm 3: 20 V für 7 min) und beginnen Sie die Übertragung. Hinweis: Proteine ​​größer als 150 kDa neigen wandern langsamer und kann eine längere Übertragungszeit von 8-10 min erfordern. Darüber hinaus wird vor der Inkubation des Gels in 20% igem Ethanol für 5-10 min auch helfen, die Übertragungseffizienz dieser große Proteine ​​zu verbessern. Sobald das Transferprogramm abgeschlossen ist, wird das Gerät automatisch die aktuelle geschlossen. Es ist am besten, sofort den Membran und gehen Sie mit der Sperrverfahren, um eine bessere Proteindetektion zu gewährleisten und zu verhindern Austrocknen der Membran. </li></ol> 4. Infrarot-Fluorescent Protein-Erkennung <ol><li> Block-Membran (en) in einem Minimum von 0,8 ml / cm 2 Odyssey Blocking Buffer (Nicht hinzufügen Tween-20) für 1 h oderüber Nacht bei 4 ° C. Membran (en) kann auch mit fettfreier Trockenmilch blockiert werden, aber dies kann höher Hintergrund verursachen und Proteinnachweis. </li><li> Inkubieren Membran (en) in primären Antikörper in der gewünschten Konzentration in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 über Nacht bei 4 ° C. Für Zweifarberkennung, in dem zwei verschiedene Antigene auf der gleichen Blot sichtbar gemacht, müssen die beiden primären Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies abgeleitet und simultan auf die Membran (en) zugegeben werden. Hinweis: Vor der Inkubation der Membran (en) in primäre Antikörper kann die Membran (en) in verschiedenen Stücke geschnitten, um für mehrere Antikörper (mehr als 2) auf der gleichen Membran sondieren. </li><li> Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x. </li><li> Inkubieren Membran (en) mit den fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:20.000 für die 700 nm-Kanal und 1:6,000-1:10,000 für die 800 nm-Kanal in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 für 30 bis 60 min (Inkubation Membran (e) für mehr als 1 Stunde kann Hintergrund erhöhen). Schützen Membran (en) aus Licht. Anmerkung: Die sekundären Antikörper müssen von der gleichen Wirtsspezies wie jede der primären Antikörpern abgeleitet und mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert werden. </li><li> Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x. Schützen Membran (en) aus Licht. </li><li> Membran (en) kann entweder getrocknet oder in TBS oder PBS gelagert werden, ohne Tween-20 bei 4 ° C bis gescannt und mit einem Infrarot-Abbildungssystem abgebildet wird. Fluoreszenzsignal wird für mehrere Monate stabil bleiben, wenn sie richtig vor Licht geschützt. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die kritischen Schritte bei der Erzeugung von qualitativ hochwertigen, quantitative Western-Blots gemäß diesem Protokoll sind folgende: 1) Messung der Proteinkonzentration, 2) Probenvorbereitung, 3) Blockierung der Membran und, 4) Qualität und Kaliber des primären Antikörpers. Die Genauigkeit der Messung der Gesamtproteinkonzentrationen können einen großen Einfluss auf die Quantifizierung von Proteinbanden, da die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Infrarot-Fluoreszenzdetektion wi...

<html> Die Technik der Western-Blot wurde erstmals zwischen 1977 und 1979, um eine bessere Methode zum Nachweis von Proteinen mit Hilfe von Antikörpern 3.1 erstellen entwickelt. Dieses Verfahren verwendet elektrophoretischen Transfer von Proteinen an Membranen, die aus SDS-PAGE-Gelen mit Zielproteinen visualisiert mit Sekundärantikörper und durch Autoradiographie, UV-Licht oder einem Peroxidase-Reaktionsprodukt 3 detektiert. Somit sind diese gleichen Grundprinzipien sind noch weitgehend in der heutigen Western-Blot-Protokolle verwendet. Allerdings ist diese klassische Western-Blot-Technik derzeit viele Nachteile, wie langsam Elektrophorese-Laufzeiten, niedrige Auflösung und künstliche Proteinbanden, die Anfälligkeit für Proteinabbau und begrenzte Empfindlichkeit als auch schlechte Datenqualität 4. Daher beschreibt dieses Protokoll signifikante Fortschritte und Verbesserungen der Standard-Western-Blot-Verfahren, die genauer qualitative und quantitative Daten erzeugt. &quot;&gt; Der Laemmli-System für die Trennung ein breites Spektrum von Proteinen mittels SDS-PAGE ist die am häufigsten verwendete Gel-System für Western-Blot-5. Trotz der Beliebtheit des Western-Blot-System, kann diese Methode in der Bandverzerrung, Verlust der Auflösung, und führen Störbänder 4. Dies kann eine Folge der Desaminierung und Alkylierung von Proteinen aufgrund der hohen pH-Wert (9,5) des Trenngel, Reoxidation des reduzierten Disulfidbindungen aufgrund der unterschiedlichen Redox-Zustand des Gels, und die Spaltung der Aspartyl-Prolyl sein Peptidbindungen durch Erwärmen des Proteins in Laemmli-Puffer (pH 5,2) 4,6. Die Bis-Tris-Gel-System, das bei einem neutralen pH-Wert (7,0) arbeitet, bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Lamemmli System. Dieses System verbessert die Proteinstabilität, minimiert Proteinmodifikationen, behält Proteine ​​in ihren reduzierten Zuständen verhindert Aspartyl-Prolyl-Spaltung während der Elektrophorese, und noch wichtiger, ist der Elektrophorese-Laufzeit 35 min 4,6,7. Zusätzlich ter Bis-Tris-Gel-System produziert auch schärfer Bands, höhere Auflösung und Trennung, und erhöhte Empfindlichkeit, was zu zuverlässigeren Daten 4. In Verbindung mit der Bis-Tris-Gel-System, verwendet der iBlot Dry-Blotting-System hohe Feldstärke und Ströme, um die Übertragungszeit von Proteinen aus Gelen deutlich reduzieren auf Membranen innerhalb von 7 min 8. Dieses Übertragungssystem ist auf dem trockenen Blotting-Verfahren, die eine effiziente und zuverlässige Übertragung von Proteinen auf der Basis 8 erzeugt. : Für einen detaillierten Vergleich der Wirksamkeit der iBlot Transfersystem zu den herkömmlichen Übertragungssystemen finden Sie in der folgenden Website <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Es verwendet eine Anode und Kathode Stapel, die aus einer Gelmatrix, die die entsprechenden Übertragungspuffer, die als Ionen Reservoirs 8 handeln enthält bestehen. Während der Übertragung, hilft die Wasserelektrolyse, die Erzeugung von Sauerstoff aus der Kupferanode, was zu einer konsistenteren Proteintransfer ohne Verzerrung Band 8 zu verhindern. Außerdem erhöht diese Übertragungssystem auch die Übertragungsgeschwindigkeit, indem der Abstand zwischen den Elektroden 8. Obwohl Chemilumineszenz ist die häufigste und traditionelle Technik zur Detektion von Protein-Western-Blot-Analysen, zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion stark die Empfindlichkeit, Qualität und Genauigkeit der Western-Blot-Daten verbessert. Dieses Nachweisverfahren nutzt Infrarot-Laser-Anregung in zwei optimalen Wellenlängen 700 nmund 800 nm, um ein klares Bild Daten mit dem größten Signal-zu-Rausch-Verhältnis und höchste Sensitivität 9 generieren. Somit können zwei Zielproteine ​​gleichzeitig auf derselben Membran unter Verwendung der 700 nm und 800 nm Fluoreszenzdetektionskanäle visualisiert werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht eine genaue quantitative Analyse von starken und schwachen Proteinbanden 9 die Linearität und den dynamischen Bereich der Infrarot-Fluoreszenz. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll enorme Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem klassischen Western-Blot-Technik durch Verringern der Elektrophorese und Übertragungszeiten dieses Experiments ohne die Wirksamkeit dieser Verfahren und Verwendung Infrarot-Fluoreszenzproteindetektion größere qualitative und quantitative Western-Blot-Daten zu erzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

Die Western-Blot-Techniken, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren gegründet wurden, sind auch heute noch aktiv genutzt. Diese traditionelle Methode des Western-Blot hat jedoch mehrere Nachteile, die Auflösung geringer Qualität, Störbänder, verminderte Empfindlichkeit und schlechte Integrität Protein enthalten. Jüngste Fortschritte haben sich drastisch verbessert, zahlreiche Aspekte des Standards Western-Blot-Protokoll, um höhere qualitative und quantitative Daten zu erzeugen. Die Bis-Tris-Gel-System, eine Alternative zu den herkömmlichen Laemmli-System, erzeugt bessere Protein Trennung und Auflösung, hält Proteinintegrität und reduziert die Elektrophorese zu 35 min Laufzeit. Darüber hinaus ist die iBlot Dry-Blotting-System, verbessert deutlich die Wirksamkeit und Geschwindigkeit der Proteintransfer auf die Membran in 7 min, was im Gegensatz zu den traditionellen Methoden, die Proteintransfer häufig ineffizient mit langen Übertragungszeiten ist. In Kombination mit diesen hoch innovativen Modifikationen, Protein Detection mit Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung führt zu höherer Qualität, genauer und konsistenter Daten im Vergleich zu den Standard-Western-Blot-Technik der Chemilumineszenz. Diese Technologie kann gleichzeitig erfassen zwei verschiedene Antigene auf derselben Membran unter Verwendung von Zweifarben-Nah-Infrarot-Farbstoffen, die in unterschiedlichen Fluoreszenzkanäle visualisiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die präzise Quantifizierung der starken und schwachen Proteinbanden die Linearität und großen Dynamik des Fluoreszenz-Bildgebung. So beschreibt dieses Protokoll die wichtigsten Verbesserungen des klassischen Western-Blot-Verfahren, bei dem diese Fortschritte die Qualität der Daten deutlich zu erhöhen, während die Leistungszeit dieses Experiments stark reduziert.

Zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenz detektiert sowohl starke als auch schwache Banden auf der gleichen Membran mit erhöhter Empfindlichkeit und dem höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis, klare Western-Blot-Bilder zu erzeugen. Typische Ergebnisse nach zweifarbige Western-Blot Nachweis sowohl im 700 nm und 800 nm Fluoreszenzkanälen sichtbar gemacht wird, wird in Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Die oberste Western-Blot in Fig. 1 zeigt die gleichzeitige (Overlay) Nachweis von...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Aufrufe.  University of California, San Francisco.  Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt. 

Serie: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Forschung

Biologie

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Chirurgische Induktion von Endolymphatischer Hydrops durch Obliteration des Ductus endolymphaticus

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation von Flachs (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...