Wir würden dank mag die folgenden für die finanzielle Unterstützung: BBSRC Institut Strategische Programmfinanzierung - CF &amp; TMW; BBSRC East Bio DTP Finanzierung - LG; Die Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Wir möchten auch an Dr. Barry McColl für die Erlaubnis, die TREM2 Optimierung in diesem Manuskript gehören danken.

<ol>
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A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. 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The authors have nothing to disclose.

Berücksichtigung und Planung ist wichtig vor jeder Experiment und kann letztlich bestimmen den Erfolg der verwendeten Technik. Die Fortschritte in Proteindetektion mit WB kann eine Fülle von potenziellen Stolpersteine ​​darstellen, wenn sie versuchen zu entscheiden, die entsprechenden Antikörper, Transfer und Visualisierungsmethoden zu bedienen. Glücklicherweise mit einer sorgfältigen Checkliste und geeignete Kontrollmaßnahmen QFWB kann routinemäßig verwendet werden, um die Protein Präsenz und immer subtiler Expressionsunterschiede zwischen den Proben zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für fluoreszierende quantitativen Western Blot sowie ein paar Fehlersuchstrategien zur Vermeidung und / oder zu überwinden einige der vielen Fallstricke mit ihm verbunden. Die kritischen Schritte verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhalten und zu erhalten wirklich quantifizierbare und vergleichbare Messungen umfassen: 1) robuste Proteinextraktion aus Gewebeproben; 2) Probenvorbereitung; 3) genaue Protein loading bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse; 4) eine optimale Übertragung von Proteinen unter Verwendung von I-Blot; 5) Herstellung von primären und sekundären Antikörper in Blockierungspuffer, enthaltend 0,1% Tween 20, und 6) richtige Visualisierung und Analyse unter Verwendung eines Infrarot-Bildwandler und der zugehörigen Software. Infrarot-Fluoreszenzdetektion ist wirklich quantitative und bietet eine höhere Empfindlichkeit gegenüber traditionelleren ECL-Nachweistechniken 3,11. Dieses Erfassungssystem ist mit mehreren Facetten, und als solche ist nicht auf QFWB beschränkt. Dieses System ist in der Lage Bildgebung von immunhistologischen Kennzeichnung bei niedriger Leistung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der gesamten Gewebeabschnitte 12. Dies ist ein Bereich von möglichen zukünftigen Entwicklung hinsichtlich der Auflösung, die weit roten Bildgebung sehen konnte rivalisierenden herkömmlichen Immunfluoreszenz Capturing mit herkömmlichen Mikroskopen im Hinblick auf quantitative Bewertung. Jedoch mit größerer Empfindlichkeit, um feine Änderungen in protein Ausdruck es entscheidend, Variabilität zu gewährleisten wird auf ein Minimum und Kontrollmaßnahmen gehalten sind streng mit robuster Protokolle. Dies beginnt mit strengen Proteinextraktion aus der Gewebeprobe, gefolgt von Produktion von Gesamtprotein gefärbten Gelen die Gewähr zu bieten, dass der Probenbeladung ist einheitlich, Optimierung der Primär- und Sekundärantikörper, um festzustellen, ob Erkennung ist real und Richtlinien des Herstellers testen bezüglich übertragen Zeiten, um eine effiziente Proteintransfer erhalten. Dennoch, auch wenn die Bedingungen für WB optimiert sind, kann es immer noch Probleme mit fließendem Western, die hier nicht vollständig erforscht worden sind, können assoziiert. Diese umfassen, sind aber nicht auf Faktoren einschließlich Protein Solubilisierung und Wahl der Extraktionspuffer begrenzt. Einige Puffer mit Proteinkonzentration Assays stören und einige Gewebe sind besonders schwierig zu solubilisieren, erfordern robustere Techniken wie die Verwendung von automatisierten macerating verschlossenen Behältnissen wie M Rohre zusammen mit einem Macs Dissociator. Zusätzlich können einfache Maßnahmen zur Kontrolle der Speicherung von nicht-extrahierten und extrahierten Materials bei -80 ° C der Unterschied zwischen den Erhalt optimaler Kennzeichnung direkt nach der Extraktion und mit schlechten Ergebnissen Wochen später. Moderne QFWB Methoden sind nachweislich für die Erfassung feine Unterschiede in der Proteinexpression empfindlicher zu sein und sind vielseitiger die gleichzeitige Doppelmarkierungen 3 im Vergleich zu älteren Techniken wie ECL. Es ist lebenswichtig, dass Western-Blot-Protokolle sind robust und leicht wiederholbaren für genaue Quantifizierung und statistische Analyse. Dieses Protokoll ist empfindlich und robust genug ist, um routinemäßig für den Nachweis von Proteinen in einer Vielzahl von verschiedenen Gewebeproben und 3 Arten verwendet werden und ermöglicht die Quantifizierung von niedrigen und hohen Fülle Proteine ​​innerhalb derselben QFWB daher reduziert Verbrauchs Nutzung sowie Zeit pro Experiment 1. 1 Darüber hinaus ist die erhöhte Empfindlichkeit dieser Technik ermöglicht die Validierung von immer beliebter - schaftlichen Studien 9,14 aber Genauigkeit ist entscheidend und Aufnahme geeigneter Kontrollmaßnahmen müssen eingehalten werden, um dadurch eine fehlerhafte Datenerfassung vermieden.

Western Blot (WB) ist eine analytische Technik, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteins von Interesse in einer komplexen biologischen Probe zu bestimmen, wie ein Gewebe-Homogenat 1. Gemeinhin als Protein Immunoblot bezeichnet, aufgrund der Schlüssel Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, die Methode besteht aus 5 Einzelschritten: 1) elektrophoretische Trennung der Proteine ​​nach ihrem isoelektrischen Punkt; 2) Übertragung auf eine Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran; 3) Markieren mit einem primären Antikörper, der spezifisch an das Protein von Interesse; 4) Inkubation mit einem gegen den primären Antikörper gerichtet sekundären Antikörper; und 5) Visualisierung. Visualisierung Methodik wurde mit der Zeit, um die Sicherheit und die Empfindlichkeit zu verbessern entwickelt. Einige der ersten WB wurden mit radioaktiv markierten Tags, die dann fortgeschritten, kolorimetrische und dann die weitere Verbreitung chemilluminescent (ECL) Verfahren durchgeführt. Radioactivity wurde direkt auf Sonden für spezifische Antigene markiert und ECL wohin kolorimetrische Methoden verwenden eine indirekte Markierungstechnik mit einem Enzym-Reporter, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin (HRP) 2. Die Intensität der Markierung des Chromagen oder lumineszierende Produkt wird mit Densitometrie, wobei die Signalstärke, stark oder schwach, zeigt mehr oder weniger das Vorhandensein des Proteins von Interesse in der Probe gemessen. ECL ist die empfindlicher und daher favorisierte Methode 2, aber alle drei Verfahren wurden zunächst auf einem Röntgenfilm mit anspruchsvolleren digitalen bildgebenden Verfahren nachträglich herausstellt, 3 entwickelt. Die Weiterentwicklung der digitalen Abbildung von WB nicht nur erlaubt, einen Forscher, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Protein von Interesse zu bestimmen, sondern auch erlaubt einen Rückschluss auf das Niveau der Expression eines ausgewählten Proteins, als gegen andere Proben verglichen und daher bezeichnet als &quot;semi-quantitative &amp; #8221 ;. Kürzlich wurde ein wirklich quantitative und empfindlichere Western Blotting Technik entwickelt worden, die das Niveau der Fluoreszenz gemessen wird, direkt auf die Menge und die Expression eines einzelnen Proteins in einer Probe bezogen werden: quantitative Fluoreszenz Western Blot (QFWB). Beim Vergleich QFWB mit ECL Kennzeichnung, die Verwendung eines fluoreszierenden sekundären Antikörper erzeugt ein lineares Erfassungsprofil 4. Dies steht im Gegensatz zu ECL Techniken, bei denen Signallinearität tritt in der Regel mit niedrigen Proteinlasten unter 5 ug und Signalsättigung direkt auf Proteinexpression bezogen, dh mit ubiquitär exprimierten Housekeeping-Gene 5,6. Diese Ungleichheit wird wahrscheinlich durch eine höhere Anzahl von Bindungsstellen zur Verfügung für eine Avidin-ECL-Substrat, der einen biotinylierten sekundären binden, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit möglicher Signalsättigung verursacht. Dies ist einer der Hauptgründe für die ECL Basis Immunoblotting ist als ONL bezeichnety &quot;semi-quantitative&quot; 7. Der Sättigungspunkt des Signals ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung von feinen Unterschieden in Expressionsniveaus und zu ungenauen Messungen führen. In den vergangenen Jahren das Aufkommen von verbreiteten Proteomiktechniken Detaillierung immer höheren Empfindlichkeit und Identifizierung von subtilen Expressionsunterschiede hat eine ständig zunehmende Abhängigkeit von wirklich quantitative Western-Blotting-Experimente zur Validierung 8,9 resultierte. Die Anwendung von empfindlichen, robust und wirklich quantitative Methodik ist daher von entscheidender Bedeutung. Viele &quot;optimiert&quot; Western-Blot-Methoden wurden von unabhängigen Labors, die häufig als schwierig erweisen aufgrund subtiler methodische Anpassungen, die nicht offensichtlich in der formalen dokumentierten Protokolle sein kann zum Einrichten oder replizieren genutzt. Dies ist eine etablierte und robustes Protokoll für QFWB und zusätzlich wertvolle Strategien für die Problembehandlung gemeinsame Probleme that kann bei der Umsetzung entstehen. Dieses Protokoll wurde ursprünglich zur Verwendung mit murinen Gehirnhomogenaten optimiert, aber seitdem effektiv über einen weiten Bereich von Gewebeproben und Arten 4,9,10 verwendet. Mögliche Protokollvarianten für spezifische Problembehandlung erforderlich sind, enthalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

Die Ende der 1970er Jahre sah die erste öffentlich berichtet Nutzung des Western-Blot, eine Technik für die Beurteilung des Vorliegens und relative Häufigkeit bestimmter Proteine ​​in komplexen biologischen Proben. Seitdem hat Western Blot Methode sich zu einem gemeinsamen Komponente des Molekularbiologen experimentellen Repertoire. Eine oberflächliche Suche in PubMed mit dem Begriff &quot;Western-Blot&quot; legt nahe, dass mehr als 220.000 veröffentlichten Manuskripte Verwendung dieser Technik bis zum Jahr 2014. Wichtig ist gemacht, haben die letzten zehn Jahre technische Bild Fortschritte gekoppelt mit der Entwicklung gesehen empfindlicher Fluoreszenzmarkierungen, die Empfindlichkeit verbessert und lieferte noch größere Bereiche der linearen Detektion. Das Ergebnis ist ein jetzt wirklich quantifizierbare Fluoreszenz Western Blot (QFWB), die Biologen die Durchführung vergleichender Expressionsanalyse mit größerer Empfindlichkeit und Genauigkeit als je zuvor ermöglicht. Viele &quot;optimiert&quot; Western-BlotMethoden existieren und werden in verschiedenen Laboratorien verwendet. Diese erweisen sich oft als schwierig zu implementieren aufgrund der Anforderung der subtilen, aber nicht dokumentierte Verfahrensänderungen. Dieses Protokoll stellt eine umfassende Beschreibung eines etablierten und robusten QFWB Verfahren, komplett mit Fehlersuchstrategien.

Als QFWB Empfindlichkeit und den linearen Bereich der Erfassung größer ist als herkömmliche ECL-Nachweis, gibt es eine Reihe von Kontrollmaßnahmen, die von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, daß genaue Daten gesammelt werden, wodurch eine effektive Auslegung unterstützt wird. Erstens die Aufnahme von positiven Kontrollproben, wie in 1 gezeigt ist. Zweitens, die Optimierung der Übertragung auf äquivalente Bewegung der hohen und niedrigen Molekulargewichts-Proteine ​​aus dem Gel auf die Membran zu gewährleisten, wie in Figur 2 gezeigt wird. Drittens, die Optimierung der Antikörper, insbesondere Sekundär Antikörper, deren Optimierung wird oft übersehen, die aber können unspezifische produzieren Banding in der Lage, sich störend auf korrekte Interpretation der Protein (e) von Interesse. Siehe 3. Viertens kann es auch der Fall sein, dass, wenn ein Protein scheint nicht nachweisbar, aber voraussichtlich anwesend zu sein, kann dies auch ein sekundärer Antikörper Frage, die durch die Verwendung eines sekundären rais korrigiert werden kannin einer anderen Spezies Host ed. Siehe 4. Fünftens ist die Gesamtproteinmarkierung und Analyse eine weitaus robuster und quantifizierbare Verfahren im Vergleich zu der Verwendung von herkömmlichen, Protein (e), die ubiquitär internen Referenzstandards 3 ausgedrückt werden. Viele dieser Einzelproteine ​​gefunden wurden differentiell in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen sowie zwischen verschiedenen Gewebeproben ausgedrückt werden und die Gleichförmigkeit des Ausdrucks innerhalb des gleichen Gewebes 3 ändern. Daher wird die Produktion eines Ladesteuer Gel die Gleichförmigkeit der Probenbeladung zu bestätigen, wenn mit einer Gesamtproteinanalyse durch Vergleichen und Quantifizierung der Proteinbelastung in jeder Spur in verschiedenen Molekulargewichten im Bereich vor jedem Muster kombiniert werden, um Standard-Fehler anzuzeigen, wie in 6 gezeigt, . Wichtig ist, dass alle diese Techniken zur Fehlerbehebung und Kontrollen sind nur so effektiv wie die Sensitivität und Konsistenz der Analyse tools durch den Betreiber (5) aufgebracht wird. Schließlich eignet sich dieses Verfahren zum Abziehen und Wieder Sondieren von Membranen mit mehr Flexibilität als ECL aufgrund von Faktoren, einschließlich, aber nicht zu einer erhöhten Empfindlichkeit, verringert Hintergrund, dual Farberkennung und Membranstabilität unter Langzeitlagerungsbedingungen beschränkt. Siehe Abbildung 7.

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Aufrufe.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Serie: A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Forschung

Biologie

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

A Practical Guide to Phylogenetics für Nichtexperten

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation von Flachs (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Entwicklung eines Quantitative Rekombinase Polymerase Amplification Assay mit einem internen positiven Kontrolle

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...