Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und der George E. Hewitt Foundation Fellowship (AP) unterstützt.

Gel-Elektrophorese Technischer Hinweis: Vor dem Start des Verfahrens haben Sie Ihre Protein-Proben bereit. Während dieses ersten Schritt werden die Proteine ​​in der Probe nach ihrem Molekulargewicht mit denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Die NuPAGE ® LDS-Probenpuffer mit Lithium-Dodecylsulfat (LDS) geladen unterhält Polypeptiden in einem denaturierten Zustand, wenn die Protein-Probe wurde bei 70 ° C für 10 Minuten erhitzt worden. Ein starkes Reduktionsmittel in Verbindung verwendet werden, um sekundäre und tertiäre Struktur (DTT, um Disulfidbrücken Pause) zu entfernen. Darüber hinaus werden Probenproteinen in die negativ geladenen LDS abgedeckt und somit durch die Acrylamid Maschen des Gels bewegen sich zur positiv geladenen Elektrode. Dies ermöglicht die Trennung nach dem Molekulargewicht (gemessen in Kilo Dalton kDa). Ausführliche Schritt-für-Schritt-Protokolle für die Probenvorbereitung und die PAGE Verfahren finden Sie auf der Website Invitrogen 2 gefunden werden, oder in der NuPAGE technische Führung 3. Technische Tipps <ol><li> In der Invitrogen NuPAGE Bis-Tris diskontinuierlichen Puffersystem ist die elektrophoretische Mobilität der Proteine ​​und die anschließende Trennung Bereich des Gels hängt von zwei Faktoren ab: i) die Acrylamid-Konzentration des Gels (mit mehr Acrylamid-Konzentration führt zu einer besseren Auflösung des unteren Molekulargewicht Proteine) und ii) der Hinterkante ion der Laufpuffer, MOPS oder MES. So wählen Sie die passende Kombination für die Trennung Bereich, den Sie erreichen wollen, um die Gel Migration Tabelle 1 beziehen. Die Dicke des Gels und der Anzahl der Bohrungen werden auf das Volumen und die Anzahl der Proben, die Sie planen zu laden, bzw. ab. </li><li> Wenn Sie Ihre Proben Last in die Vertiefungen des Gels ist mindestens eine Fahrspur für ein Molekulargewichtsmarker (oder Leiter) vorbehalten. Diese Protein-Standards sind im Handel von mehreren Unternehmen zur Verfügung und in der Regel aus einer Mischung von gefärbten Proteine ​​mit definierten Molekulargewichten bestehen, so dass sichtbare Bänder, die Sie für die Migration Fortschritt folgen lassen zu bilden. Wählen Sie einen Bereich von Molekulargewichten, die mit Ihren Gel-Auflösung ist. </li><li> Um eine schöne und sogar Migrationsmuster empfehlen wir das Laden aller Bohrlöcher des Gels mit einem ähnlichen Volumen der Probe oder 1X LDS-Probenpuffer. </li></ol> Transfer Technische Anmerkung: Vor Beginn der Übertragung Schritt, bereiten Sie die Transfer-Puffer (1X mit 10% Methanol) und pre-cool bis 4 ° C in einem kalten Raum. Um die Proteine ​​zugänglich Antikörpernachweis zu machen, werden sie durch Elektroblotting aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Proteinbindung ist auf hydrophobe Wechselwirkungen sowie Ladungs-Wechselwirkungen zwischen der Membran und Protein. (Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran kann auch als Alternative verwendet werden. In diesem Fall muss die PVDF-Membran zu pre-Nass-in Methanol mindestens 30 Sekunden vor dem Gebrauch.) Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll der Übertragung Verfahren kann in Bezug 4 zu finden, wenn Sie die Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektrophoretische Übertragung Cell, oder in Verweisen 2-3, wenn Ihr Labor mit dem Invitrogen XCell II ausgestattet ist verwenden ™ Blot Module. Als Ergebnis dieses Prozesses werden die Proteine ​​auf eine dünne Oberflächenschicht ausgesetzt und bereit für die Erkennung. Die Einheitlichkeit und die allgemeine Wirksamkeit der Übertragung von Protein aus dem Gel auf die Membran kann durch Farbstoff Membran der reversiblen Ponceau S-Färbung überprüft werden. Ponceau S-Färbung Verfahren (optional): <ol><li> Nach dem Übertragen der Proteine, legen Sie die Membran in einer Inkubationswanne (Proteine ​​nach oben). </li><li> Fügen Sie genug Ponceau S-Färbung der Membran abdecken und inkubieren Sie mindestens 30 Sekunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülen Sie Membran mit destilliertem Wasser, bis der Hintergrund klar ist. </li><li> Entfärben der Membran mit fließendem destilliertem Wasser für 2-3 Minuten. </li><li> Legen Sie die Membran in Blocking-Lösung (siehe unten). </li></ol> Technische Tipps: <ol><li> Wir empfehlen Kennzeichnung Ihrer Membran mit einem Bleistift vor-Protein übertragen, um die Seite in dem die Proteine ​​wurden ausgesetzt und die Ausrichtung Ihrer Proben zu bezeichnen. </li><li> Beide Ponceau S-Färbung und der Molekulargewichtsmarker verwendet werden, um die Membran nach der Übertragung für die Erforschung der resultierenden Teile mit unterschiedlichen Antikörpern geschnitten werden </li></ol> Immundetektion: Technische Anmerkung: Diese Immundetektion Verfahren ist lediglich als Leitfaden zur Verfügung gestellt. Optimierung kann für jede Ameise erforderlichibody, spezifische Informationen finden Sie in den meisten Datenblättern der kommerziell erhältliche Antikörper (zB Gebrauchsverdünnung, Inkubationszeit, etc.) gefunden werden. Während dieses letzten Prozesses wird das Zielprotein unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers und wird als Band auf dem Film erscheinen. Die Lage der Bande ist abhängig von dem Molekulargewicht des Zielproteins, während die Band Intensität hängt von der Menge an Ziel-Proteins vorhanden. Normalerweise ist dies nach drei Teilschritten erreicht: <ol><li> Blocking: Um unspezifische Wechselwirkungen der Antikörper mit der Membran (die überschüssige Speicherplatz auf der Membran wird mit einer verdünnten Lösung eines generischen Protein verdeckt) zu vermeiden. </li><li> Probing: Das Protein von Interesse ist durch eine spezifische erkannt <a title="Primärer Antikörper" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">Primärantikörper</a> . Nach dem ungebundenen primären Antikörper weggewaschen wird, ist die Membran auf einem anderen Antikörper in Verbindung mit dem Reporter ausgesetzt <a title="Enzym" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">Enzyms</a> , <a title="Meerrettichperoxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">Meerrettichperoxidase</a> (HRP). Dieser sekundäre Antikörper ist gegen die Spezies-spezifische Teil des primären Antikörpers (z. B. eine Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper wird jedes Kaninchen-Source-Primär-Antikörper binden) gerichtet. </li><li> Detection: A Chemilumineszenz Agent wird als ein Substrat, das leuchten, wenn die HRP auf dem sekundären Antikörper ausgesetzt werden. Diese Reaktion erzeugt Lumineszenz in Ort und im Verhältnis zu der Menge an Protein untersucht. Das Licht wird dann von fotografischen Filmen erkannt. </li></ol> Ein generisches Schritt-für-Schritt-Verfahren ist unten angegeben. Weitere detaillierte Verfahren kann in der ECL Plus Western Blotting Detektionsreagenzien Bedienungsanleitung 5 oder in den meisten Datenblatt Begleitung der kommerziell erhältliche Antikörper gefunden werden. Inkubationszeit, Antikörperverdünnung und Sperr-und Waschlösungen wurden empirisch für jedes Antikörpers optimiert werden. Immundetektion Verfahren: <ol><li> Blockieren Sie die unspezifische Bindung durch Inkubation mit genügend Volumen PBS 1% Casein blockiert Lösung für die gesamte Membran abzudecken. Legen Sie auf einer Wippe für mindestens 30 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit dem primären Antikörper (spezifisch für das Protein von Interesse). Der primäre Antikörper sollten in Blocking-Lösung verdünnt werden. Für die meisten Antikörper, abgeschlossen ist verbindlich nach 1-2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln erreicht. Alternativ kann der Inkubationsschritt über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. </li><li> Entfernen Sie die Lösung (zu verwerfen oder zu halten bei 4 ° C bis -20 ° C für die wiederholte Verwendung) und schnell waschen der Membran wieder. Dann 3X10 Minuten mit PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln. </li><li> Inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-gekoppelten sekundären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt. Wählen Sie ein Antikörper, der IgG Teil der Arten, bei denen der primäre Antikörper wurde angehoben erkennt. Die Inkubationszeit ist für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt. </li><li> Entsorgen Sie die Lösung schnell und waschen Sie die Membran einmal. Dann 3X10 Minuten mit PBST bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln. </li><li> Fahren Sie mit dem Chemilumineszenz-Detektion nach Angaben des Herstellers Belehrung. Wir nutzen die ECL Plus Western Blotting Detection-Reagenzien von GE Healthcare (siehe Referenz 5 für Anweisungen). </li><li> Zeigen Sie mit der Membran in Frischhaltefolie oder einem Beutel und im Inneren eine Autoradiographie-Kassette. Vergewissern Sie sich, um überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen und entfernen Sie alle Luftblasen. </li><li> Expose des fotografischen Films auf die Membran in einem dunklen Raum. Beginnen Sie mit einer 1 Minute Einwirkzeit und passen je nach gewünschter Signalintensität. </li></ol> Technische Tipps: <ol><li> Blockierung der unspezifischen Bindung wird erreicht, indem die Membran in einer verdünnten Lösung des Proteins erreicht. Wir verwenden in der Regel 1% Casein, aber <a title="Rinderserumalbumin" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">Rinderserumalbumin</a> (~ 2% BSA) oder fettfreie Trockenmilch (~ 5%) kann als Alternative verwendet werden. </li><li> Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) können während des gesamten Verfahrens anstelle von PBS verwendet werden. Wir empfehlen die Verwendung TBS, wenn Sie Ihre Membran mit phosphospezifische Antikörper-Sonde zu planen. </li><li> Die Verwendung eines glow-in-the-dark-Aufkleber (zB Stratagene Glogos ® II Autorad Marker) in der Unterseite der Autoradiographie Kassette abgehört wird Ihnen helfen, Ihr Film und Ihre Membran während der Analyse Schritt auszurichten. </li></ol> Analyse Jetzt haben Sie Ihren Film belichtet, werden Sie feststellen, dass in der Praxis nicht alle Westerns Proteins aufdecken als eine schöne Single-Band. Additional Bands kann auch auftreten, aufgrund der nicht-spezifische Bindung von primären und sekundären Antikörper. Dieser Hintergrund-Signal kann durch die Optimierung der Immundetektion Verfahren reduziert werden. Darüber hinaus wird eine entsprechende Steuerung (zB nicht transfizierten Zellen, siRNA-behandelten Zellen, etc.) nützlich sein, um die Spezifität der Antikörper und Ihr die genaue Lage des Zielproteins auf der Membran zu bestimmen. Nach der Markierung auf dem Film die Position des gefärbten Proteins Standard-Bands aus der Membran, Grundstück das Protokoll von jedem Molekulargewicht der Protein-Standards (y-Achse) gegen die entsprechenden relativen Mobilität (x-Achse). Relative Mobilität (Rf) ist die Bezeichnung für das Verhältnis der Entfernung des Proteins aus seinem Ursprung (oben auf dem Gel) bezogen auf den Abstand der Tracking-Farbstoff oder ein niedermolekularer Marker bewegt hat eingesetzt bewegt hat (das Gel vorne) . Bestimmen Sie die Regressionsgerade der Standardkurve, um Werte für Steigung und y-Achse zu erhalten. Der unbekannte Molekulargewicht (Größe) des Zielproteins wird geschätzt, mit ihrer Rf und die folgende modifizierte Gleichung: log Molekulargewicht = (Steigung) (Mobilität oder Rf des Zielproteins) + y-Achsenabschnitt (Siehe Referenz 6 für detaillierte Anweisungen). Expression Ebene Annäherungen sind durch den Vergleich der Bandenintensität des Zielproteins, dass ein strukturelles Protein (z. B. Tubulin oder Actin) oder ein Housekeeping-Gen-Produkt wie GAPDH genommen. Diese so genannte &quot;loading control&quot; sollte nicht zwischen den Proben zu ändern und offenbart mit einem spezifischen primären Antikörper. Das Bild kann durch Densitometrie der relativen Menge an Protein Färbung zu bewerten und zu quantifizieren, die Ergebnisse in Bezug auf die optische Dichte analysiert werden.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet eine Bis-Tris-Gel mit MES-Laufpuffer als ein Beispiel für denaturierende PAGE mit dem Invitrogen NuPAGE Novex Elektrophorese-System. Darüber hinaus ermöglicht diese pre-cast-Gel-System Protein Trennung unter denaturierenden oder nicht denaturierenden Bedingungen sowie Platz für eine breite Palette von Molekulargewichten (1 bis 200 kDa für das Bis-Tris Gele 36-400 kDa für das Tris- Acetat-Gele). Abhängig von Ihrem Experiment, können Sie festlegen, dass nur ein Teil der Western-Blotting hier b...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blot (oder Immunoblot) ist ein Standard Laborverfahren erlauben Ermittler auf die Expression eines Proteins zu überprüfen, Bestimmung der relativen Menge des Proteins in verschiedenen Proben und analysieren die Ergebnisse der Co-Immunopräzipitation Experimenten. In diesem Verfahren wird ein Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt nachgewiesen. Protein Trennung nach Molekulargewicht erfolgt über denaturierende SDS-PAGE. Nach dem Transfer auf eine Membran, wird das Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper untersucht und nachgewiesen durch Chemilumineszenz. Seit seiner ersten Beschreibung hat die Western-Blot-Technik eine Reihe von Verbesserungen, darunter Fertiggele und benutzerfreundliche Geräte unterzogen. In unserem Labor haben wir uns entschieden, das im Handel erhältliche NuPAGE Elektrophorese-System von Invitrogen verwendet. Es ist ein innovatives pH-neutral, diskontinuierliche SDS-PAGE, pre-cast Mini-Gel-System. Dieses System bietet mehrere Vorteile gegenüber dem traditionellen Laemmli-Technik einschließlich: i) eine längere Haltbarkeit der Fertiggele von 8 Monaten bis zu 1 Jahr; ii) eine breite Trennung Bereich von Molekulargewichten von 1 bis 400 kDa, abhängig von der Art Gel verwendet werden, und iii) eine größere Vielseitigkeit (Bereich von Acrylamid Prozentsatz, der Art des Gels, und die ionische Zusammensetzung der Laufpuffer). Das Verfahren in diesem Video Artikel beschrieben nutzt die Bis-Tris diskontinuierlichen Puffersystem mit 4-12% Bis-Tris Gradientengele und MES-Laufpuffer, als Beispiel dafür, wie ein Western-Blot mit Hilfe der Unter Invitrogen NuPAGE Elektrophorese-System. In unserem Labor haben wir eine gute und reproduzierbare Ergebnisse für verschiedene biochemische Anwendungen mit diesem Western-Blot-Methode erhalten.

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI). Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Serie: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Forschung

Biologie

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...