Dieses Protokoll kann eine variable methodische Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der kranialen Dura mater auf den physiologischen oder pathologischen Zustand liefern. Unter Nutzung der transparenten Whole Mount Dura Mater kann die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in einer 3D-Ansicht demonstriert werden. Nach dem Einschläfern einer Ratte transkardiert mit 100 Millilitern 0,9% normaler Kochsalzlösung, gefolgt von 250 bis 300 Millilitern 4% Paraformaldehyd in 0,1 Molarphosphatpuffer.
Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel, um die Dura mater und die dorsale Seite des Gehirns freizulegen. Sezieren Sie die Kranialdura mater entlang des Hirnstamms bis zum Riechkolben in einem ganzen Montagemuster. Spülen Sie die Kranialdura mater in 0,1 Molarphosphatpuffer für etwa eine Minute aus und inkubieren Sie sie in einer blockierenden Lösung.
Übertragen Sie die Dura mater über Nacht in den Anti-CGRP-Antikörper der Maus. Am folgen Tag die Dura mater dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer waschen. Inkubieren Sie die Dura mater in einer Mischlösung aus Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper und Phalloidin 568 in 0,1.
Molarer Phosphatpuffer mit 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X-100 für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Dura mater dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer, trimmen Sie die Kanten und montieren Sie sie auf Objektträgern. Vor der Beobachtung auf Deckzettel mit 50% Glycerin legen.
Stellen Sie sich die gesamte Mount Dura Mater mit einem Fluoreszenzmikroskop ab und machen Sie dann Bilder der immunreaktiven CGRP-Nervenfasern und Phalloidin-markierten Blutgefäße in der Dura mater mit einem konfokalen Mikroskop. Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einem elektrischen Rasierer, legen Sie dann stumpfe Ohrbügel auf die Ratte und legen Sie sie auf das stereotaxische Gerät. Positionieren Sie den Mundhalter und tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf.
Reinigen Sie die chirurgische Seite der Kopfhaut mit 75% Ethanol und machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut. Entfernen Sie das Periost und das Muskelgewebe mit sterilen Applikatoren mit Baumwollspitze stumpf vom Schädel entfernt. Bohren Sie ein kleines Loch mit einem Gratbohrer mit einem runden Spitzenbiss an den linken Parietal- und Schläfenknochen oberhalb der mittleren Meningealarterie.
Bauen Sie eine Bank um das Loch mit Dentalsilikatzement und fügen Sie zwei Mikroliter Fluorgold in das Loch um die mittlere Meningealarterie mit einer 10-Mikroliter-Mikrospritze hinzu. Bedecken Sie das Loch mit einem kleinen Stück hämostatischem Schwamm. Legen Sie ein Stück Paraffinfilm auf das Loch und versiegeln Sie die Kanten mit Knochenwachs.
Nähen Sie die Wunde mit sterilem Faden. Halten Sie die Ratten in einem warmen Bereich, bis sie sich vollständig erholt haben. Dann bringen Sie die Ratten zurück in ihre Käfige.
Nach sieben Überlebenstagen perfundieren Sie diese Ratten mit 0,9% normaler Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 Molarphosphatpuffer. Sezieren Sie die TG und die zervikalen ein bis vier DRGs und schneiden Sie sie dann mit einer Dicke von 30 Mikrometern auf einem Kryostatmikrotomsystem in sagittaler Richtung. Und montieren Sie die Profile auf silanbeschichteten Glasobjektträgern.
Umkreisen Sie die Abschnitte mit einem histochemischen Pen und inkubieren Sie sie für 30 Minuten in Blocklösung. Die Proben in die Lösung von Kaninchen-Anti-Fluorgold- und Maus-Anti-CGRP-Antikörpern überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Abschnitte dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer waschen.
Inkubieren Sie die gewaschenen Abschnitte in einer Mischlösung aus Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 und Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper. Dann waschen Sie sie dreimal in 0,1 molaren Phosphatpuffer und tragen Sie Zur Beobachtung Deckzettel mit 50% Glycerin auf. Nehmen Sie Bilder der Fluorgold-markierten Neuronen in TG und DRGs unter UV-Beleuchtung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.
Nehmen Sie dann Bilder der Fluorgold- und CGRP-markierten Neuronen in TG und DRGs auf. Nach immunfluoreszierender und fluoreszierender histochemischer Färbung mit CGRP und Phalloidin wurden CGRP-immunreaktive Nervenfasern und Phalloidin-markierte Duralarterien und Bindegewebe im gesamten Mount Cranial Dura Mater in einem 3D-Muster deutlich visualisiert. Sowohl dicke als auch dünne immunreaktive CGRP-Nervenfasern verlaufen parallel zu den Duralarterien um die Gefäßwand oder zwischen den Blutgefäßen.
Sieben Tage nach der Anwendung von Fluorgold auf den Bereich der Arteria middle meningeal und des Schädels dura mater der Ratte wurden die fluorgoldmarkierten Neuronen in TG und zervikalen DRGs auf der ipsilateralen Seite der Tracerapplikation nachgewiesen, was direkt unter der UV-Beleuchtung der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde. Fluorgold-markierte Neuronen wurden in allen drei Zweigen des TG gefunden, mit höheren Konzentrationen auf der Augen- und Oberkieferabteilung und mit niedrigeren Konzentrationen auf der Unterkieferteilung. Einige der Fluorgold-markierten Neuronen wurden auch in den zervikalen zwei bis drei DRGs beobachtet.
Diese repräsentativen Doppelimmunfluoreszenzfotos zeigen sensorische Neuronen in TG und DRG. Die markierten Neuronen mit FG, CGRP und sowohl FG als auch CGRP wurden durch doppelte Immunfluoreszenz visualisiert. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die Kranialdura mater vollständig zu sezieren und auf eine Rutsche in einem ganzen Mount-Muster einzufügen.
