Eine normale Blutversorgung der Cochlea ist von entscheidender Bedeutung für die Cochlea Morbus Menière, insbesondere für die Aufrechterhaltung des Cochlea-Potenzials in Innenräumen, das die wesentliche treibende Kraft für die Transaktion von Haarzellen ist. Diese Funktion der Durchblutung wurde eng mit verschiedenen Formen von Hörverlust in Verbindung gebracht. Ein besseres Verständnis des Cochlea-Blutflusses ermöglicht eine effektivere Behandlung von Hörstörungen, die auf Blutflussstörungen zurückzuführen sind.
Die direkte Blutflussmessung ist jedoch aufgrund der Schwierigkeit, das Innenohr zu beurteilen, sehr schwierig. Techniken zur Beurteilung des Cochlea-Blutflusses befinden sich derzeit noch in der Entwicklung. Hier demonstrieren wir eine der neuesten Methoden, die in unserem Labor etabliert wurden, öffnen das Muskelfenster in der Anpassung mit einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop, um den Cochlea-Blutfluss bei Kleintierarten wie Mäusen einzuschränken.
Die Anwendung dieser Technik mit transgenetischen Massenmodellen hat das Potenzial, die Forschung voranzutreiben, um die Zusammenhänge zwischen der Hörfunktion und der Pathologie im Zusammenhang mit dem Cochlea-Blutfluss bei intravaskulärem Risiko zu entschlüsseln. Unsere Verfahren sollten mit Vorsicht durchgeführt werden. Zusätzlich zu den momentanen Körperblutungen müssen die Vitalfunktionen des Tieres, einschließlich Blutdruck und Herzschlag, während der Operation überwacht werden.
Beginnen Sie mit dem Sammeln von etwa einem Millimeter Blut in Heparin durch Herzpunktion. Zentrifugieren Sie das Blut bei 3000 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Plasma und waschen Sie dann das Blutzellenpellet dreimal mit einem Milliliter PBS durch Zentrifugieren bei 3000 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.
Markieren Sie die Blutzellen mit einem Milliliter 20 Mikromolar DiO oder Dil in PBS und inkubieren Sie im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die markierten Blutzellen mit einem Milliliter PBS und zentrifugieren Sie dreimal bei 3000 mal G für drei Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet vor der Injektion in 30% Hämatokrit mit etwa 0,9 Milliliter PBS.
Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente und Bildgebungsplattform vor und legen Sie ein Heizkissen unter den Vorhang. Überwachen Sie den schlechten Reflex und den allgemeinen Muskeltonus der anästhesierten Mäuse, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen. Legen Sie das Tier auf das warme Heizkissen und seinen Schwanz in das Monitorsystem zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag.
Halten Sie die rektale Temperatur bei 37 Grad Celsius und zeichnen Sie den systolischen Blutdruck, den diastolischen Blutdruck und den mittleren Blutdruck des Tieres im betäubten Zustand auf. Öffnen Sie die linke Paukenbulle über einen seitlichen und ventalen Zugang unter einem Stereomikroskop, wobei das Trommelfell und die Gehörknöchelchen intakt bleiben. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie des Halses des Tieres mit immobilisiertem Kopf, um die Bewegung zu minimieren.
Entfernen Sie die linke Unterkieferdrüse und den hinteren Bauch des Digastrmuskels und kauterisieren. Lokalisieren und exponieren Sie die knöcherne Bulle, indem Sie den sternocleidomastoideus Muskel und den Gesichtsnerv identifizieren, die sich vor der Bulle erstrecken. Öffnen Sie die knöcherne Bulle mit einer 30-Gauge-Nadel und entfernen Sie den umgebenden Knochen vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette, um eine freie Sicht auf die Cochlea- und Stapedialarterie mit ihrem medialen Rand zu erhalten, der über dem Rand der runden Fensternische liegt und eine vordere Oberseite zum ovalen Fenster verursacht.
Verwenden Sie eine kleine Messerklinge, um den seitlichen Wandknochen an der Spitze der mittleren Drehung der Mauscochlea etwa 1,25 Millimeter von der Spitze entfernt abzukratzen, bis eine dünne Stelle gerissen ist. Entfernen Sie die Knochenspäne mit kleinen Drahthaken. Decken Sie das Gefäßfenster mit einem geschnittenen Abdeckglas ab, um normale physiologische Bedingungen zu erhalten, und bieten Sie eine optische Ansicht für die Aufnahme von Gefäßbildern.
Machen Sie einen Zentimeterschnitt entlang der rechten Stammvene, um das Gefäß freizulegen. Gießen Sie nacheinander jeweils 100 Mikroliter der FITC-Dextran-Lösung und der Blutzellsuspension durch die Stammvene in das Tier, um die Visualisierung der Blutgefäße und die Verfolgung des Blutflusses zu ermöglichen. Beobachten Sie den Blutfluss fünf Minuten nach der Injektion in Echtzeit auf einem Videomonitor.
Bilden Sie die Blutgefäße mit einem Fluoreszenzmikroskop ab, das mit einem Objektiv für große Arbeitsentfernungen und einem Lampengehäuse ausgestattet ist, das einen Mehrband-Anregungsfilter und einen kompatiblen Emissionsfilter enthält. Nehmen Sie das Video mit einer hochauflösenden digitalen Schwarzweißkamera auf, die mehr als 350 Bilder pro Video aufnimmt. Um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten.
Messen Sie den Gefäßdurchmesser mit einer geeigneten Software und bestimmen Sie den Abstand zwischen zwei festen Punkten über das Gefäß in den aufgenommenen Bildern. Öffnen Sie das Video des Blutflusses in der Software und stellen Sie die Skala der Bilder ein. Verfolgen Sie die ausgewählten DiO-gefärbten Blutzellen mit der Tracking-Funktion.
Verwenden Sie dann die Entfernung, die sich die Zellen bewegt haben, und das Zeitintervall zwischen den Bildbildern im Video zur automatischen Berechnung der Strömungsgeschwindigkeit. Berechnen Sie den Volumenstrom anhand der im Textmanuskript angegebenen Gleichung. Um das Lärmexpositionsmodell vor der Blutflussaufzeichnung zu erstellen, setzen Sie die Tiere in Maschendrahtkäfige und setzen sie drei Stunden lang Breitbandlärm bei 120 Dezibel Schalldruckpegel in einer Schallexpositionskabine aus.
Dann für weitere drei Stunden am nächsten Tag. Zeichnen Sie den Blutfluss zwei Wochen nach der Lärmbelastung auf. Nach chirurgischer Exposition der Cochlea-Kapillaren in der Seitenwand wurde eine intravitale hochauflösende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung von DiL-markierten Blutzellen in FITC-Dextran-markierten Gefäßen durch ein offenes Gefäßfenster durchgeführt.
DiL-markierte Blutzellen in Stria Gefäßen, die mit FITC Dextran markiert sind, sind hier dargestellt. Dio-markierte Blutzellen, die mit FITC Dextran markiert sind, zeigen, dass die Gefäßdichte des Spiralbandes spärlicher ist als die des dichteren Stria vascularis. Hochauflösende IVM zeigt die Blutflussmuster in Kontroll- und Lärmgruppen.
Das gestörte Muster der Durchblutung ist in den lärmexponierten Gruppen zu sehen. Zu den Anomalien gehörten ein verringerter Gefäßdurchmesser und eine erhöhte Variation des Gefäßdurchmessers. Die Blutflussgeschwindigkeiten in den Kontroll- und Lärm-exponierten Gruppen wurden berechnet, indem die Wurzeln der DiO-markierten Blutzellen verfolgt wurden.
Die Blutgeschwindigkeit und das Blutvolumen in der lärmexponierten Gruppe waren signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Die erfolgreiche Etablierung des offenen Gefäßfensters erfordert ein hohes Maß an chirurgischem Geschick. Beim Entfernen des Knochens der Cochlea-Seitenwand ist Vorsicht geboten.
