Das gesamte Protokoll nach der Zellisolation dauert ca. 2 Stunden. 1. Mikrochirurgische Vorbereitung <ol><li> Führen Stammzellen isoliert von der Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung der isolierten Subpopulation nach standardisierten Protokollen 9,12 sodass die Zellen während der Zeit der Tieroperation durchgeführt ruhen. Für die Fluoreszenzmarkierung empfehlen wir CFDA (Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester). </li><li> Betäuben einer männlichen Maus mit einem Gewicht von 20-25 g mit Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (2,5 mg / kg). Während der chirurgischen Verfahren und Versuchsprotokolle sollten Anästhesie durch Ergänzungen erhalten werden (10% der anfänglichen Injektion ip) nach Bedarf (in der Regel alle 30-60 min). </li><li> Rasur sanft die Vorderseite des rechten Hodensack sowie den rechten Oberschenkel und Leiste. Sammeln Sie alle verlieren Haare mit einem angefeuchteten Wattestäbchen. Platzieren Sie die Maus Bauchseite nach oben auf einem Plexiglas-Sicht Bühne und fixieren Sie die Gebührt mit elastischem Tuch. Die Bühne ist maßgeschneidert, bestehend aus einer Grundplatte und einer zweiten Platte am kaudalen Rand der Grundplatte für die Erhebung beider Beine und Hodensack. Zeigen die Bühne auf einem Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten Nach der Fixierung auf die Bühne, legen Sie das Tier unter einem Operationsmikroskop und die folgenden Arbeitsschritte unter Verwendung von 10 - bis 16-facher Vergrößerung. </li><li> Machen Sie den ersten Schnitt mit Haut Schere am rechten Oberschenkel, nur der vordere Oberschenkelgefäße vom Knie bis in die Leistengegend. </li><li> Identifizieren Sie die Oberschenkelarterie und folgen ihm proximal mobilisiert die Arterie von Weichgewebe umgeben. Identifizieren und schneiden Sie ein großer Ast auf den linken Hoden mit Thermokauter. Danach legen Sie einen Aufenthalt Naht oberflächlich am linken Hoden. Sanfte Traktion weiter proximal Mobilisierung der Oberschenkelarterie zu erleichtern. </li><li> Nach Abschluss des proximalen Mobilisierung, zu identifizieren und schneiden eine große Filiale läuft MEDIALLy am Oberschenkel von Thermokauter. Danach ligieren die Femoralarterie in den distalen Teil des rechten Oberschenkels. Sanfte Traktion auf der Ligatur wird Hilfe weitere Vorbereitung. </li><li> Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf den proximalen Arteria femoralis wieder und legen Sie eine Naht um die Arterie so proximal wie möglich. Bereiten Sie einen Knoten, sondern binden Sie es nicht noch nach unten. Bewerben leichten Zug an der Naht, und erstellen Sie eine arterielle Knicken. </li><li> Nach der Gründung der Knicken einzuschneiden die Arterie vorsichtig mit einem microscissor. Achten Sie besonders darauf, die Vena femoralis beschädigen. </li><li> Legen Sie eine vorbereitete Mikrokatheter (Innendurchmesser 0,28 mm) über den Schnitt. Der Katheter muss entlüftet werden (0,9% Natriumchlorid, NaCl) und mit einer 1 ml Spritze vor Einsetzen verbunden. </li><li> Nach erfolgreicher Einführung des Katheters vorsichtig den Knicken zu lösen, um den Durchgang des Katheters zu erleichtern. Arterielle Blutfluss innerhalb des Katheters sofort sichtbar sein. Sanft voran der Katheter ein paar Millimeters über die bisherige Knicken. Danach binden Sie die vorbereitete Ligatur zur Fixierung des Katheters. </li><li> Spülen Sie vorsichtig den Katheter (0,9% NaCl) und saugen, um die korrekte Position zu bestätigen. Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um weiter zu sichern, den Katheter in die Betriebsphase. </li><li> Nach ausreichender Fixierung, setzen Sie den Katheter beiseite für die folgenden Schritte zur Vorbereitung der Cremaster-Muskel. Bewerben regelmäßige Spülung und Aspiration des Katheters alle 5-10 min, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. </li><li> Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf die rechte Hodensack und einen Einschnitt durch Schneiden der Haut und Faszie über dem ventralen Aspekt der rechten Hodensack. Achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe mit allen Instrumenten berühren. </li><li> Erweitern der Einschnitt bis zur Leistenbeuge und kaudal zu dem distalen Ende des Hodensacks. </li><li> Sorgfältig separaten zugrunde liegenden weich und Bindegewebe über dem Cremaster Sack, ohne es zu berühren. Identifizieren Sie das distale Ende des Cremaster und legen hier einen Aufenthalt Naht an slightly verlängern die Muskeln. Resezieren jetzt noch weiche Gewebe unter der Muskel-Sack durch leichtes Ziehen die Muskeln kaudal und anterior. </li><li> Nach der vollständigen Trennung von Bindegewebe, öffnen Sie den Cremaster-Sack an einem Punkt auf der Schädel Rand mit einer Schere. Erweitern Sie den Schnitt von dieser Öffnung nach unten bis zum distalen Ende des Muskels. </li><li> Verschließen Sie den kleinen Schiff verbindet den Hoden und der Cremaster mit Thermokauter, danach schneiden Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen Muskel und Hoden mit einer Schere. </li><li> Beiseite legen den Hoden, aus dem Bereich der Mikroskopie. </li><li> Die geöffnete Cremaster legt nun flach auf der Bühne. Legen Sie vier 6-0 Prolene Haltefäden an den Rändern des Gewebes und befestigen Sie sie mit elastischen Tuch um den Cremaster-Muskel-Gewebe ausbreiten. Von nun an ständig befeuchten das Gewebe mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 1 ml Spritze (Abbildung 1). </li><li> Jetzt erlauben die Vorbereitung zur Ruhe für 15 min. Danach spritzen0,05-0,1 ml 1% Rhodamin-Dextran über die linke Oberschenkelarterie zur Kontrastverstärkung des Mikrogefäßsystems. Falls Chemokine oder entzündungshemmende Mittel sind für den Einsatz geplant, sollten Sie jetzt topisch befeuchten den Muskel mit der jeweiligen Reagens unter Verwendung einer 1 ml Spritze. Im Falle eines Kontrollversuchs, weiterhin Befeuchten mit PBS. </li></ol> 2. Intravitalmikroskopie <ol><li> Halten Sie das für den Betrieb der Bühne fixiert Maus und bewegen sich unter einem Fluoreszenzmikroskop für Auflicht-Beleuchtung modifiziert und auf eine CCD (Charge-Coupled Device)-Videokamera verbunden. Achten Sie besonders darauf, den Oberschenkelarterienkatheter verrenken. </li><li> Führen Experimente mit einem Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Nach der Einstellung des Ziel für eine ausreichende Darstellung der Cremaster die Mikrozirkulation und vor der Zellinjektion, stochastisch definieren sechs postkapillären Venolen für die spätere Analyse der Unternehmensstammzellhaftung. </li><li> Verwalten Fluoreszenz-markierten Stammzellen,in 200 ul PBS gelöst, mit 0,4 × 10 6 Zellen pro Injektion, mit insgesamt fünf aufeinanderfolgenden Injektionen unter Verwendung des Oberschenkelarterienkatheter und einer 1 ml-Spritze. Die Zellprobe vor der ersten Injektion vorsichtig schütteln. </li><li> Rekord Stammzellen sofort rollt nach Zellinjektion, wobei die Definition &quot;Rollen&quot; als mehr als 50% Reduktion der Zellgeschwindigkeit entlang der endothelialen Auskleidung in Kombination mit typischen zellulären &quot;Stick and release&quot; Bewegungen. Führen Zählung der Roll Stammzellen und Stammzellen alle Gabe eines vordefinierten venulären Distanz während 1 min Beobachtungs nach jeder einzelnen Injektion. Die Menge der Stammzellwalzen als Prozentsatz aller Durch Zellen exprimiert. Zählen Sie nicht Zellen, die zufällig kurz Tethering Phänomene als Rollzellen. </li><li> Nach der letzten Injektion Zelle bestimmen die Anzahl der festhaftenden Stammzellen durch Zählen und drücken die Menge im Verhältnis zu der berechneten endothelialen Oberfläche the sechs vordefinierten Venolen (Durchmesser x Länge x π) als adhärenten Zellen / mm 2. Firm Haftung gilt, wenn kein Zellbewegung ist für 30 Sekunden nachweisbar. </li><li> Nach Abschluss der Intravitalmikroskopie vorsichtig den M. cremaster und speichern sie in Übereinstimmung mit späteren Analyse (Immunhistochemie und Molekularbiologie). Sacrifice das Tier durch Genickbruch. Die Analyse der Intravitalmikroskopie-Aufnahmen für die Quantifizierung der Stammzellroll und fest endotheliale Adhäsion, sowie mikrovaskuläre Hämodynamik, wie rote Blutkörperchen Geschwindigkeit (mm / s), der Schiffslänge (um), Gefäßdurchmesser (um), Wandanteil Rate (s -1); sollte offline von einem Ermittler auf die jeweilige experimentelle Gewebebehandlung mittels eines Bildverarbeitungssoftware blind durchgeführt werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

Alle Tierversuche, für dieses Manuskript durchgeführt wurden, von der lokalen Tierpflege und die Nutzung genehmigt worden. Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

<html> Intravitalfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen. Der Cremaster-Muskel-Modell ist besonders nützlich, da mikrochirurgischen Techniken Intravital Belichtung und Visualisierung haben sich etabliert in der Forschung auf Leukozyten-Endothel-Interaktionen und verschiedenen chemischen Komponenten können durch einfache Superfusionstechnik selektiv an das Zielgewebe angewendet werden. Aufgrund der Abwesenheit von Bewegungsartefakten und...

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Technik der Intravitalmikroskopie (IVM) auf der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die direkte Beobachtung und Analyse der peripheren Knochenmark-Stammzellen angewendet Migration zu beschreiben. Das aktuelle Konzept der Stammzell Gewebe-und Organregeneration beinhaltet die Homing von Knochenmark-Stammzellen in die verletzte Gewebe ein. Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Stammzell-Migration beinhaltet die Stammzell Interaktion mit der lokalen Endothel innerhalb des verletzten Organ, gefolgt von transendotheliale Migration und schließlich Organ Transplantation 2. Intravital Analyse dieser Stammzellen - Endothelzell-Interaktionen bildet einen idealen Parameter für die Quantifizierung einer Stammzellregenerationsreaktion in verschiedenen pathophysiologischen Einstellungen in vivo. Ferner erscheint es denkbar, dass in der Zukunft, intravital Analyse der Migrationsfähigkeit spezifischer Stammzellen populations innerhalb der Mikrozirkulation standardisierten Umgebungen kann angewendet werden, bevor fort diese Bevölkerungs weitere klinische Tests. Intravitalmikroskopie wurde ursprünglich für die Beobachtung und Quantifizierung der Leukozyten-Endothel-Zell-Wechselwirkung in vivo im Bereich der Entzündungsforschung 3 entwickelt. Erste erfolgreiche Aufnahmen von Intravitalmikroskopie Studien wurden von Cohnheim bereits im 19. Jahrhundert berichtet, Studium Froschzungen und Gekröse unter einem Lichtmikroskop 4. Seit seinem ersten Einsatz IVM hat eine enorme technische Entwicklung durchgemacht und ist heute bestimmte wesentliche Komponenten bilden Voraussetzungen, um quantitative IVM durchführen: (i) Gewebezubereitungen, die optischen Zugang zu ermöglichen, (ii) molekulare Sonden, die mit einem Mikroskop erkannt werden können, (iii ) ein Mikroskop, um ein Detektionssystem und (iv) Computer-basierte Analyse-Systeme, die interessierenden Parameter aus den Bilddaten zu extrahieren anschließbarSet 4. Eine Vielzahl von Gewebepräparationen für IVM Studien einschließlich der Mesenterien und Leber der Maus und der Ratte 5, den Rückenhautkammern 6 der Maus und Hamster, Kaninchenohr und der Hamsterbackentasche ein paar zu nennen eingeführt. Doch im folgenden werden wir auf der Maus Cremaster-Muskel, was eine ideale Gewebe für die Intravital Beobachtungen zu konzentrieren, als Vorbereitung und Visualisierung von einem gut standardisierten chirurgischen Eingriff möglich ist, und in der Regel keine Probleme von Bewegungsartefakten kommen. Die offene Cremaster-Muskel-Präparat wurde zum ersten Mal in den 1970er Jahren von Baez Kollegen und 7 durchgeführt. Ursprünglich für Ratten beschrieben, wurde auch erfolgreich auf die Maus 8 angenommen. Nach früheren Studien hatte vor allem auf Leukozyten-Interaktionen mit der Gefäßwand konzentriert, vor kurzem unsere eigene Gruppe die Maus Cremaster-Muskel-Präparat als BewertungsBLE Werkzeug für die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen innerhalb einer definierten Mikro 9. Verschiedene Stammzellpopulationen untersucht die Verwendung dieses Modells, einschließlich murinen c-kit + Knochenmarkstammzellen und mesenchymale Stammzellen, sowie Menschen CD 133 + Knochenmarkstammzellen 10-12. Nach der Zellisolation aus Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung zur Anzeige, werden die Stammzellen selektiv in die Cremaster Mikrozirkulation unter Verwendung eines arteriellen Injektion über die Oberschenkelarterie eingesetzt, wodurch jede Zelle Einschließen in entfernte Organe vermieden. Darüber hinaus ist der Cremaster-Muskel-Modell besonders nützlich, da verschiedene Chemokine potenziell Vermittlung lokalen Stammzellmigration innerhalb der jeweiligen Einstellungen können lokal auf dem Zielgewebe durch einfache Superfusionstechnik angewendet werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

In der Ära der intravaskulären Zellanwendungsprotokolle im Rahmen der regenerativen Zelltherapie, die zugrunde liegenden Mechanismen der Stammzellmigration, um Gewebe nonmarrow nicht vollständig geklärt. Wir beschreiben hier die Technik der Intravitalmikroskopie an der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellmigration in vivo angewendet. Intravitalmikroskopie des M. cremaster zuvor im Bereich der Entzündungsforschung für die direkte Beobachtung der Leukozyten-Wechselwirkung mit dem vaskulären Endothel eingeführt. Da eine ausreichende Umfangs Stamm-und Vorläuferzellmigration umfasst ähnliche anfänglichen Schritte entlang rollen und feste Haftung am Endothel es denkbar, den M. cremaster Modell für die Beobachtung und Quantifizierung der Wechselwirkung intravasculary verabreicht Stammzellen mit dem Endothel anzuwenden. Verschiedene chemische Komponenten selektiv an das Ziel t aufgetragen werdenProblem durch einfache Superfusionstechniken ist es möglich, wesentliche Voraussetzungen für die Mikroumgebungs ersten Stammzellrekrutierung, um in einem lebenden Organismus außerhalb des Knochenmarks nehmen zu etablieren.

Im allgemeinen Zusammenspiel von direkt eingespritzt Stamm-oder Vorläuferzellen mit dem vaskulären Endothel innerhalb der M. cremaster Mikrozirkulation ist ein seltenes Ereignis und tritt ausschließlich in postkapillären Venolen (Durchmesser: 30 bis 80 um). Aufgrund Fluoreszenzmarkierung Walzen und fest haftenden Stammzellen deutlich getrennt von zirkulierenden endogenen Leukozyten in den Venen beobachtet (Fig. 2) quantifiziert werden. Die Mikrozirkulationsbedingungen du...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Aufrufe.  University Rostock.  Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert. 

Serie: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Forschung

Biologie

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualisierung und Quantifizierung der zellfreien Schicht in Arteriolen der Ratte Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse der Gap-Junction-abhängigen Übertragung von miRNA mit 3D-FRAP-Mikroskopie

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...