Serielle Kristallographie-Experimente können eine Herausforderung darstellen. Eine wesentliche Hürde in ihrer Praxis ist die Herstellung mikrokristalliner Proben. Dieses Protokoll zeigt, wie solche Proben zuverlässig erstellt werden können.
Diese Methode verwendet Endothiapepsin, um einen Rahmen für die Optimierung großer Kristalle zu schaffen, die in kleinvolumigen Dampfdiffusionsplatten zu großvolumigen mikrokristallinen Schlämmen gezüchtet wurden. Wir können nicht behaupten, dass dieses Protokoll universell erfolgreich sein wird. Wir hoffen jedoch, dass die hier vorgeschlagenen Ideen und Methoden anderen einen experimentellen Rahmen bieten, den sie auf andere Proteine anwenden können.
Bereiten Sie zunächst eine 96-Well-Platte mit zwei Tropfen und dem Kristallisationspuffer mit dem Formulatrix-Roboter vor. Mischen Sie mit einem Liquid-Handling-Robotermix 150 Nanoliter frisch aufgetautes Endothiapepsin mit 150 Nanolitern Kristallisationspuffer in jeder Vertiefung. Versiegeln Sie die Platte und lassen Sie die Kristalle 24 Stunden lang im Formulatrix Hotel wachsen.
Brechen Sie nach 24 Stunden die Kristalle auf und entfernen Sie sie aus fünf Vertiefungen der 96-Well-Kristallisationsplatte. Geben Sie sie in 250 Mikroliter des Kristallisationspuffers in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in einem Eiskübel. Geben Sie 10 bis 15 Glasperlen von einem Millimeter Größe in das Zentrifugenröhrchen.
Wirbeln Sie die Kristalle und Perlen 30 Sekunden lang mit 1000 Umdrehungen pro Minute und legen Sie sie 30 Sekunden lang auf Eis. Die Samen können dann sofort verwendet oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um ein Morphogramm-Experiment durchzuführen, fügen Sie fünf bis 40 %ige Konzentrationen von PEG 6000 mit einem molaren Tris-HCl bei pH sieben und 0,15 molaren Magnesiumchlorid entlang der Plattensäulen eines 96-Well-Gittersiebs mit zwei Tropfen hinzu Reparieren Sie eine sequentielle Verdünnung von Endothiapepsin in 0,1 molaren Natriumacetat von 100 auf 12,5 Milligramm pro Milliliter in acht Schritten.
Dann pipettieren Sie acht Mikroliter jeder Verdünnung, gefolgt von zwei Mikrolitern Saatgut, in die Platte des Liquid-Handling-Roboters. Geben Sie mit einem Liquid-Handling-Roboter 150 Nanoliter jeder Verdünnung von Endothiapepsin in die Unterwells eins und zwei des Siebs. 50 Nanoliter aufgetautes Saatgut und 100 Nanoliter der Well-Lösung aus Sub-Well zwei mehrfach aspirieren und beides in die Proteinlösung geben.
Mischen Sie die Lösungen dreimal unter Zugabe des Kristallisationspuffers oder des Kristallisationspuffers und der Saatgutmischung. Versiegeln Sie nun die Platte und das Bild bei null, drei, sechs, 12, 18 und 24 Stunden des ersten Tages jeden Tag in der ersten Woche und jede Woche für die nächsten vier Wochen bei 20 Grad Celsius. Schauen Sie sich nach 24 Stunden die Platte unter einem Mikroskop an, schätzen Sie die Anzahl der Kristalle in jeder Vertiefung und messen Sie eine Probe der Kristalle.
Notieren Sie diese Schätzungen im bereitgestellten Arbeitsblatt für den Morphogrammgenerator. Geben Sie die Ausgangskonzentrationen von Endothiapepsin und PEG 6000 in die entsprechenden Felder ein. Das Arbeitsblatt stellt die Ergebnisse automatisch im traditionellen Phasendiagrammformat mit den Fällmittel- und Proteinkonzentrationen auf der X- bzw. Y-Achse dar.
Well-Bedingungen, die nur Kristalle in ihren gesäten Tropfen hervorbringen, deuten auf die MetaStable-Region des Diagramms hin, während Bedingungen mit Kristallen sowohl in den gesäten als auch in den nicht entkernten Tropfen die Nukleationszone anzeigen. Wählen Sie aus der Morphogrammanalyse die vielversprechendste Bedingung für die Skalierung in 24-Well-Platten aus. Beginnen Sie dann mit 100 Milligramm Endothiapepsin pro Milliliter und 35% PEG 6000.
Bereiten Sie fünf Milliliter Kristallisationspuffer mit 35 % PEG 6000, 0,1 molaren Tris-HCl mit pH sieben und 0,15 molar Magnesiumchlorid vor. Geben Sie nun 0,5 Milliliter des Kristallisationspuffers in drei Vertiefungen einer gefetteten 24-Well-Hängefallplatte. Mischen Sie 15 Mikroliter Endothiapepsin mit 15 Mikrolitern Kristallisationslösung auf einem Glasdeckglas.
Geben Sie die Lösung über die Vertiefungen und lassen Sie die Platte 24 Stunden lang stehen. Schauen Sie sich die Platte nach 24 Stunden unter dem Mikroskop an, schätzen Sie die Anzahl der Kristalle im Tropfen und messen Sie ihre Größe. Wenn die Kristalle falsch sind, wiederholen Sie diesen Schritt, ändern Sie jedoch die Proteinkonzentration oder fügen Sie Samen hinzu, wenn die Kristallkeimbildung nicht hoch genug ist.
Wiederholen Sie das 24-Well-Skalierungsexperiment, indem Sie Samen mit einer höheren Konzentration von PEG 6000 hinzufügen. Geben Sie 0,5 Milliliter des neuen Kristallisationspuffers in drei Vertiefungen einer gefetteten 24-Well-Hängetropfplatte. Geben Sie 15 Mikroliter Endothiapepsin auf ein Glasdeckglas und mischen Sie fünf Mikroliter Samenbrühe und 10 Mikroliter Kristallisationslösung mit der Endothiapepsinlösung.
Drehen Sie die Deckgläser um, legen Sie sie über die Vertiefungen und lassen Sie sie 24 Stunden einwirken. Überprüfen Sie die Tropfen erneut, um zu sehen, ob die Kristalle kleiner sind und eine höhere Konzentration aufweisen. Schätzen Sie die Anzahl der Kristalle im Tropfen und messen Sie ihre Größe erneut, um zu sehen, ob sie jetzt die richtige Größe haben.
Um ein Seeded-Batch-Protokoll durchzuführen, bereiten Sie den Kristallisationspuffer aus 40 % PEG 6000, 0,1 molaren Tris-HCl mit einem pH-Wert von sieben und 0,15 molaren Magnesiumchlorid vor. 50 Mikroliter Saatgut und 100 Mikroliter Kristallisationslösung vormischen und im 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Proteinlösung mischen. Wirbeln Sie das Rohr 10 Sekunden lang und stellen Sie es bei 20 Grad Celsius auf eine Wippe oder einen Shaker.
Nehmen Sie alle 20 Minuten 2,5 Mikroliter Aliquot der Batch-Lösung ein. Überwachen Sie die Größe und Anzahl der Kristalle mit einem Hämozytometer. Zählen Sie die Anzahl der Kristalle und messen Sie ihre Größe unter dem Mikroskop.
Wenn die Kristalle eine Dimension von etwa 15 μm erreicht haben, wird die Reaktion mit 150 Mikrolitern 0,5 molaren Natriumacetat abgeschreckt, das mit 0,5 molaren Tris-HCl, 0,075 molaren Magnesiumchlorid und 20 % PEG 6000 ergänzt wird. Überprüfen Sie die Kristallgröße und -konzentration erneut mit dem Hämozytometer. Lagern Sie die Kristalle bei 20 Grad Celsius.
Die Analyse des Endothiapepsin-Morphogramms deutete darauf hin, dass die Nukleation sowohl von Protein- als auch von Fällmittelkonzentrationen beeinflusst wurde. Die MetaStable-, Nukleations- und Präzipitationsbereiche des Diagramms können gut unterschieden werden. Die Zugabe von Samen erhöhte die Kristallzahl im Vergleich zu Tropfen ohne Samen signifikant.
Die Analyse der Endothiapepsin-Mikrokristallisation in 200 bis 300 Mikroliter-Volumina zeigte die Veränderungen in der Kristallkeimbildung und die längste Dimension im Zeitverlauf. Die Erhöhung der PEG-Konzentration auf 35 % verbesserte die Kristallisation deutlich, mit einer Endkristallkonzentration von etwa 3,6 mal 10 bis sechs pro Milliliter und der längsten Kristalldimension von 42 Mikrometern. Um die Größe der endgültigen Kristalle zu reduzieren, wurde ein Ansatz zur Reduzierung der Proteinkonzentration angewendet, der leider die Kristallkonzentration erheblich reduzierte und letztendlich noch größere Kristalle erzeugte.
Der Ansatz, die PEG-Konzentration auf 40 % zu erhöhen, ergab jedoch Kristalle etwa 3,1 mal 10 bis sechs pro Milliliter und eine Größe von etwa 39 Mikrometern. Darüber hinaus führte die Zugabe von Samen zu einem signifikanten Anstieg der Kristallkonzentration, etwa 1,1 mal 10 zu acht pro Milliliter und kleineren Abmessungen von etwa 4,2 Mikrometern. Der in der Kristallisationsreaktion versuchte Abschreckeffekt ergab eine endgültige Kristallkonzentration von etwa 2,6 mal 10 zu sechs pro Milliliter und eine Größe von etwa 15 Mikrometern.
Die CC-Hälfte, die gegen die Auflösung der Röntgendaten aufgetragen wurde, zeigte eine leichte Abnahme der Kristallauflösung von 10 Mikrolitern auf 200 bis 300 Mikroliter Volumen. Der Kristall beugte sich jedoch immer noch auf 1,5 Angstrum, was als ausreichend erachtet wurde. Endothiapepsin ist ein verzeihendes Protein, mit dem man arbeiten kann.
Wir hoffen, dass die Erprobung dieses Protokolls von Endothiapepsin nützliche Ideen und Methoden für andere Proteine hervorbringen wird. Besonders bei der Kristallographie ist es von Vorteil, zu sehen, wie die Dinge aussehen und sich anfühlen, anstatt zu versuchen, nur einem schriftlichen Protokoll zu folgen. Dieses Video wird Ihnen hoffentlich etwas von diesem Gefühl vermitteln.
