Los experimentos de cristalografía en serie pueden ser un desafío. Un obstáculo clave en su práctica es la creación de muestras microcristalinas. Este protocolo muestra cómo se pueden crear dichas muestras de manera confiable.
Este método utiliza endotiapepsina para proporcionar un marco para optimizar cristales grandes cultivados en placas de difusión de vapor de pequeño volumen en lodos microcristalinos de gran volumen. No podemos afirmar que este protocolo será universalmente exitoso. Sin embargo, esperamos que las ideas y métodos propuestos aquí den a otros un marco experimental para emplear en otras proteínas.
Para comenzar, prepare una placa de pocillos de 96 gotas de dos gotas con el tampón de cristalización utilizando el robot Formulatrix. Usando una mezcla de robot de manejo de líquidos, mezcle 150 nanolitros de endotiapepsina recién descongelada con 150 nanolitros del tampón de cristalización en cada pozo. Selle la placa y deje que los cristales crezcan durante 24 horas dentro del Hotel Formulatrix.
Después de 24 horas, rompa y retire los cristales de cinco pocillos de la placa de cristalización de 96 pocillos. Colóquelos en 250 microlitros del tampón de cristalización en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros colocado en un cubo de hielo. Agregue de 10 a 15 perlas de vidrio de un milímetro de tamaño en el tubo de centrífuga.
Vortex los cristales y cuentas a 1000 RPM durante 30 segundos, y reemplácelos en hielo durante 30 segundos. Las semillas se pueden usar de inmediato o almacenar a menos 20 grados centígrados. Para realizar un experimento de morfograma, agregue concentraciones de cinco a 40% de PEG 6000 con un molar de Tris-HCl a pH siete y cloruro de magnesio molar de 0.15 a lo largo de las columnas de la placa de una pantalla de rejilla de 96 pocillos de dos gotas Reparar una dilución secuencial de endotiapepsina en acetato de sodio molar 0.1 de 100 a 12.5 miligramos por mililitro en ocho pasos.
Luego pipetear ocho microlitros de cada dilución seguidos de dos microlitros de material de semillas en la placa del robot de manejo de líquidos. Usando un robot de manejo de líquidos, dispensar 150 nanolitros de cada dilución de endotiapepsina en subpocillos uno y dos de la pantalla. Multi-aspirar 50 nanolitros de semilla descongelada y 100 nanolitros de la solución de pozo del sub-pozo dos y dispensar ambos en la solución de proteína.
Mezclar las soluciones tres veces después de la adición del tampón de cristalización o tampón de cristalización y la mezcla de semillas. Ahora selle la placa y la imagen a cero, tres, seis, 12, 18 y 24 horas del primer día todos los días durante la primera semana y cada semana durante las próximas cuatro semanas a 20 grados centígrados. Después de 24 horas, mire la placa bajo un microscopio, estime el número de cristales dentro de cada pocillo y mida una muestra de los cristales.
Registre estas estimaciones en la hoja de trabajo del generador de morfogramas proporcionada. Introduzca las concentraciones iniciales de endotiapepsina y PEG 6000 en las cajas apropiadas. La hoja de trabajo trazará automáticamente los resultados en el formato tradicional de diagrama de fases con las concentraciones de precipitante y proteína en los ejes X e Y, respectivamente.
Las condiciones de pozo que solo dan lugar a cristales en sus gotas sembradas indican la región MetaEstable del diagrama, mientras que las condiciones con cristales tanto en las gotas sembradas como en las no sembradas indican la zona de nucleación. A partir del análisis del morfograma, seleccione la condición más prometedora para escalar en placas de 24 pocillos. Luego comience con 100 miligramos por mililitro de endotiapepsina y 35% PEG 6000.
Prepare cinco mililitros de tampón de cristalización con 35% PEG 6000, 0.1 molar Tris-HCl con pH siete y 0.15 molar cloruro de magnesio. Ahora coloque 0,5 mililitros del tampón de cristalización en tres pocillos de una placa de gota colgante engrasada de 24 pocillos. Mezcle 15 microlitros de endotiapepsina con 15 microlitros de solución de cristalización en un cubreobjetos de vidrio.
Coloque la solución sobre los pocillos y deje la placa durante 24 horas. Después de 24 horas, mire la placa bajo un microscopio, estime el número de cristales en la gota y mida su tamaño. Si los cristales son incorrectos, repita este paso, pero cambie la concentración de proteína o agregue semillas si la nucleación del cristal no es lo suficientemente alta.
Repita el experimento de escalado de 24 pocillos agregando semillas a una concentración más alta de PEG 6000. Coloque 0,5 mililitros del nuevo tampón de cristalización en tres pocillos de una placa de gota colgante engrasada de 24 pocillos. Coloque 15 microlitros de endotiapepsina en un cubreobjetos de vidrio y mezcle cinco microlitros de semilla y 10 microlitros de solución de cristalización con la solución de endotiapepsina.
Invierta los cubiertos, colóquelos sobre los pozos y déjelos durante 24 horas. Vuelva a revisar las gotas para ver si los cristales son más pequeños y tienen una concentración más alta. Estime el número de cristales en la gota y mida su tamaño nuevamente para ver si ahora tienen el tamaño correcto.
Para realizar un protocolo de lote sembrado, prepare el tampón de cristalización de 40% PEG 6000, 0.1 molar Tris-HCl con un pH de siete y 0.15 molar cloruro de magnesio. Premezcle 50 microlitros de material de semilla y 100 microlitros de solución de cristalización, y mezcle con una solución de proteína en el tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Vortex el tubo durante 10 segundos y colóquelo en un balancín o agitador a 20 grados centígrados.
Tomar una alícuota de 2,5 microlitros de la solución discontinua cada 20 minutos. Controle el tamaño y el número de cristales con un hemocitómetro. Cuente el número de cristales y mida su tamaño bajo el microscopio.
Cuando los cristales hayan alcanzado aproximadamente 15 micras de dimensión, apague la reacción con 150 microlitros de acetato de sodio molar 0.5 suplementado con 0.5 molar Tris-HCl, cloruro de magnesio molar 0.075 y 20% PEG 6000. Vuelva a comprobar el tamaño y la concentración del cristal con el hemocitómetro. Guarde los cristales a 20 grados centígrados.
El análisis del morfograma de endotiapepsina sugirió que la nucleación estaba influenciada tanto por las concentraciones de proteínas como de precipitantes. Las regiones MetaStable, nucleación y precipitación del diagrama se pueden distinguir muy bien. La adición de semillas aumentó significativamente el número de cristales en comparación con las gotas sin semillas.
El análisis de la microcristalización de endotiapepsina en volúmenes de 200 a 300 microlitros reveló los cambios en la nucleación cristalina y la dimensión más larga a lo largo del tiempo. El aumento de la concentración de PEG al 35% mejoró notablemente la cristalización, con una concentración final de cristal de alrededor de 3,6 veces 10 a seis por mililitro, y la dimensión cristalina más larga de 42 micrómetros. Para reducir el tamaño de los cristales finales, se aplicó un enfoque de reducción de la concentración de proteínas, que desafortunadamente redujo significativamente la concentración de cristales y, en última instancia, produjo cristales aún más grandes.
Sin embargo, el enfoque de aumentar la concentración de PEG al 40% produjo cristales alrededor de 3.1 veces 10 a seis por mililitro y un tamaño de aproximadamente 39 micrómetros. Además, la adición de semillas condujo a un aumento significativo en la concentración de cristales, alrededor de 1.1 veces 10 a ocho por mililitro y dimensiones más pequeñas de aproximadamente 4.2 micrómetros. El efecto de enfriamiento intentado en la reacción de cristalización dio una concentración final de cristal de alrededor de 2,6 veces 10 a seis por mililitro y un tamaño de aproximadamente 15 micrómetros.
La mitad CC trazada contra la resolución de los datos de rayos X mostró una ligera disminución en la resolución de cristal de los volúmenes de 10 microlitros a 200 a 300 microlitros. Sin embargo, el cristal todavía difractaba a 1.5 angstrum, que se consideró suficiente. La endotiapepsina es una proteína indulgente con la que trabajar.
Esperamos que probar este protocolo de endotiapepsina genere ideas y métodos útiles para otras proteínas. Particularmente con la cristalografía, es beneficioso ver cómo se ven y se sienten las cosas en lugar de tratar de seguir solo un protocolo escrito. Esperamos que este video te dé algo de esa sensación.
