Seri kristalografi deneyleri zor olabilir. Uygulamalarındaki önemli bir engel, mikrokristalin numunelerin oluşturulmasıdır. Bu protokol, bu tür örneklerin nasıl güvenilir bir şekilde oluşturulabileceğini gösterir.
Bu yöntem, küçük hacimli buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen büyük kristalleri büyük hacimli mikrokristalin bulamaçlara optimize etmek için bir çerçeve sağlamak için endotiapepsin kullanır. Bu protokolün evrensel olarak başarılı olacağını iddia edemeyiz. Bununla birlikte, burada önerilen fikir ve yöntemlerin başkalarına diğer proteinler üzerinde kullanmak için deneysel bir çerçeve sunmasını umuyoruz.
Başlamak için, Formulatrix robotunu kullanarak kristalizasyon tamponu ile iki damla 96 kuyu plakası hazırlayın. Bir sıvı taşıma robotu karışımı kullanarak, 150 nanolitre taze çözülmüş endotiyapepsin, her bir kuyucukta 150 nanolitre kristalizasyon tamponu ile karıştırın. Plakayı kapatın ve kristallerin Formulatrix Hotel'de 24 saat boyunca büyümesine izin verin.
24 saat sonra, kristalleri parçalayın ve 96 delikli kristalizasyon plakasının beş kuyucuğundan çıkarın. Bunları bir buz kovasına yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde kristalizasyon tamponunun 250 mikrolitresine yerleştirin. Santrifüj tüpüne bir milimetre boyutunda 10 ila 15 cam boncuk ekleyin.
Kristalleri ve boncukları 1000 RPM'de 30 saniye boyunca vorteks edin ve 30 saniye boyunca buz üzerinde değiştirin. Tohumlar daha sonra hemen kullanılabilir veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Bir morfogram deneyi gerçekleştirmek için, pH yedide bir molar Tris-HCl ile% beş ila% 40 PEG 6000 konsantrasyonları ve iki damla 96 delikli bir ızgara ekranının plaka sütunları boyunca 0.1 molar sodyum asetat içinde 0.1 molar sodyum asetat içinde endotiapepsinin sıralı seyreltilmesini sekiz adımda mililitre başına 100 ila 12.5 miligram arasında onarın.
Daha sonra her seyreltmenin sekiz mikrolitresini pipetleyin ve ardından iki mikrolitre tohum stoğunu sıvı taşıma robot plakasına yerleştirin. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, endotiapepsinin her seyreltilmesinden 150 nanolitresini ekranın bir ve iki alt kuyucuğuna dağıtın. 50 nanolitre defrosted tohum stoğunu ve 100 nanolitre kuyu çözeltisini iki kuyu altından çoklu aspire edin ve her ikisini de protein çözeltisine dağıtın.
Kristalleşme tamponu veya kristalizasyon tamponu ve tohum karışımı eklendikten sonra çözeltileri üç kez karıştırın. Şimdi plakayı ve görüntüyü ilk haftanın her günü sıfır, üç, altı, 12, 18 ve 24 saatinde ve sonraki dört hafta boyunca her hafta 20 santigrat derecede kapatın. 24 saat sonra, mikroskop altında plakaya bakın, her bir kuyucuktaki kristal sayısını tahmin edin ve kristallerin bir örneğini ölçün.
Bu tahminleri sağlanan morfogram oluşturucu çalışma sayfasına kaydedin. Endotiapepsin ve PEG 6000'in başlangıç konsantrasyonlarını uygun kutulara girin. Çalışma sayfası, sonuçları sırasıyla X ve Y eksenindeki çökeltici ve protein konsantrasyonları ile geleneksel faz diyagramı biçiminde otomatik olarak çizecektir.
Sadece tohumlanmış damlalarında kristallere yol açan iyi koşullar, diyagramın MetaStable bölgesini gösterirken, hem tohumlanmış hem de tohumlanmamış damlalarda kristalleri olan koşullar çekirdeklenme bölgesini gösterir. Morfogram analizinden, 24 kuyucuk plakasına ölçeklendirmek için en umut verici koşulu seçin. Daha sonra mililitre endotiapepsin başına 100 miligram ve% 35 PEG 6000 ile başlayın.
% 35 PEG 6000, pH yedi ile 0.1 molar Tris-HCl ve 0.15 molar magnezyum klorür ile beş mililitre kristalizasyon tamponu hazırlayın. Şimdi kristalizasyon tamponunun 0,5 mililitresini yağlanmış 24 delikli asılı bir damla plakasının üç kuyucuğuna yerleştirin. Bir cam kapak kayması üzerinde 15 mikrolitre endotiapepsin ile 15 mikrolitre kristalizasyon çözeltisi ile karıştırın.
Çözeltiyi kuyucukların üzerine yerleştirin ve plakayı 24 saat bekletin. 24 saat sonra, mikroskop altında plakaya bakın, damladaki kristal sayısını tahmin edin ve boyutlarını ölçün. Kristaller yanlışsa, bu adımı tekrarlayın, ancak protein konsantrasyonunu değiştirin veya kristal çekirdeklenmesi yeterince yüksek değilse tohum ekleyin.
Daha yüksek bir PEG 6000 konsantrasyonunda tohum ekleyerek 24 kuyucuklu ölçeklendirme deneyini tekrarlayın. Yeni kristalizasyon tamponunun 0,5 mililitresini, yağlanmış 24 delikli asılı bir damla plakasının üç kuyucuğuna yerleştirin. Bir cam kapak fişine 15 mikrolitre endotiapepsin yerleştirin ve beş mikrolitre tohum stoğu ve 10 mikrolitre kristalleşme çözeltisini endotiapepsin çözeltisi ile karıştırın.
Kapak fişlerini ters çevirin, kuyucukların üzerine yerleştirin ve 24 saat bekletin. Kristallerin daha küçük olup olmadığını ve daha yüksek bir konsantrasyona sahip olup olmadığını görmek için damlaları tekrar kontrol edin. Düşüşteki kristallerin sayısını tahmin edin ve şimdi doğru boyutta olup olmadıklarını görmek için boyutlarını tekrar ölçün.
Tohumlu parti protokolünü gerçekleştirmek için,% 40 PEG 6000, pH değeri yedi olan 0.1 molar Tris-HCl ve 0.15 molar magnezyum klorür kristalizasyon tamponunu hazırlayın. 50 mikrolitre tohum stoğu ve 100 mikrolitre kristalizasyon çözeltisini önceden karıştırın ve 1.5 mililitre santrifüj tüpünde protein çözeltisi ile karıştırın. Tüpü 10 saniye boyunca vorteks edin ve 20 santigrat derecede bir rocker veya çalkalayıcıya yerleştirin.
Her 20 dakikada bir 2,5 mikrolitrelik bir toplu çözelti aliquot alın. Bir hemositometre kullanarak kristallerin boyutunu ve sayısını izleyin. Kristallerin sayısını sayın ve mikroskop altında boyutlarını ölçün.
Kristaller yaklaşık 15 mikron boyuta ulaştığında, reaksiyonu 0.5 molar Tris-HCl, 0.075 molar magnezyum klorür ve% 20 PEG 6000 ile desteklenmiş 150 mikrolitre 0.5 molar sodyum asetat ile söndürün. Hemositometreyi kullanarak kristal boyutunu ve konsantrasyonunu tekrar kontrol edin. Kristalleri 20 santigrat derecede saklayın.
Endotiyapepsin morfogram analizi, nükleasyonun hem protein hem de çökeltici konsantrasyonlarından etkilendiğini göstermiştir. Diyagramın MetaStable, çekirdeklenme ve yağış bölgeleri güzel bir şekilde ayırt edilebilir. Tohumların eklenmesi, tohumsuz damlalara kıyasla kristal sayısını önemli ölçüde arttırdı.
200 ila 300 mikrolitre hacimdeki endotiapepsin mikro kristalizasyonunun analizi, kristal çekirdeklenmesindeki değişiklikleri ve zaman içindeki en uzun boyutu ortaya koymuştur. PEG konsantrasyonunun% 35'e çıkarılması, mililitre başına altıya yaklaşık 3.6 kat 10 ila altı arasında bir nihai kristal konsantrasyonu ve 42 mikrometrelik en uzun kristal boyutu ile kristalleşmeyi belirgin şekilde iyileştirdi. Son kristallerin boyutunu azaltmak için, maalesef kristal konsantrasyonunu önemli ölçüde azaltan ve sonuçta daha büyük kristaller üreten bir protein konsantrasyonu azaltma yaklaşımı uygulandı.
Bununla birlikte, PEG konsantrasyonunu% 40'a çıkarma yaklaşımı, mililitre başına altıya yaklaşık 3.1 kat 10 ila 10 arasında kristaller ve yaklaşık 39 mikrometrelik bir boyut elde etti. Ayrıca, tohumların eklenmesi, kristal konsantrasyonunda, mililitre başına sekize yaklaşık 1.1 kat 10 ve yaklaşık 4.2 mikrometrelik daha küçük boyutlarda önemli bir artışa yol açtı. Kristalleşme reaksiyonunda denenen söndürme etkisi, mililitre başına altıya yaklaşık 2.6 kat 10 ila 10 arasında bir nihai kristal konsantrasyonu ve yaklaşık 15 mikrometrelik bir boyut verdi.
X-ışını verilerinden elde edilen çözünürlüğe karşı çizilen CC yarısı, kristal çözünürlüğünde 10 mikrolitreden 200 ila 300 mikrolitre hacimlere hafif bir düşüş gösterdi. Bununla birlikte, kristal hala yeterli görülen 1.5 angstrum'a kırıldı. Endotiapepsin, çalışmak için affedici bir proteindir.
Bu endotiapepsin protokolünü denemenin diğer proteinler için yararlı fikirler ve yöntemler üreteceğini umuyoruz. Özellikle kristalografide, sadece yazılı bir protokolü takip etmeye çalışmak yerine, şeylerin nasıl göründüğünü ve hissettiğini görmek faydalıdır. Bu video umarım size bu hissin bir kısmını verecektir.
