Les expériences de cristallographie en série peuvent être difficiles. Un obstacle clé dans leur pratique est la création d’échantillons microcristallins. Ce protocole montre comment de tels échantillons peuvent être créés de manière fiable.
Cette méthode utilise l’endothiapepsine pour donner un cadre d’optimisation des gros cristaux cultivés dans des plaques de diffusion de vapeur de petit volume en boues microcristallines de grand volume. Nous ne pouvons pas prétendre que ce protocole connaîtra un succès universel. Cependant, nous espérons que les idées et les méthodes proposées ici donneront à d’autres un cadre expérimental à utiliser sur d’autres protéines.
Pour commencer, préparez une plaque de 96 puits à deux gouttes avec le tampon de cristallisation à l’aide du robot Formulatrix. À l’aide d’un mélange robotisé de manipulation de liquides, mélanger 150 nanolitres d’endothiapepsine fraîchement décongelée avec 150 nanolitres de tampon de cristallisation dans chaque puits. Scellez la plaque et laissez les cristaux croître pendant 24 heures à l’intérieur de l’hôtel Formulatrix.
Après 24 heures, briser et retirer les cristaux de cinq puits de la plaque de cristallisation de 96 puits. Placez-les dans 250 microlitres du tampon de cristallisation dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre placé dans un seau à glace. Ajouter 10 à 15 billes de verre d’un millimètre dans le tube à centrifuger.
Tourbillonnez les cristaux et les perles à 1000 tr / min pendant 30 secondes et replacez-les sur la glace pendant 30 secondes. Les graines peuvent ensuite être utilisées immédiatement ou stockées à moins 20 degrés Celsius. Pour effectuer une expérience de morphogramme, ajouter cinq à 40% de concentrations de PEG 6000 avec une molaire Tris-HCl à pH sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium le long des colonnes de plaque d’un criblage quadrillé à 96 puits à deux gouttes Réparer une dilution séquentielle de l’endothiapepsine dans 0,1 molaire d’acétate de sodium de 100 à 12,5 milligrammes par millilitre en huit étapes.
Ensuite, pipeter huit microlitres de chaque dilution suivis de deux microlitres de stock de graines dans la plaque du robot de manipulation de liquide. À l’aide d’un robot de manipulation de liquides, distribuer 150 nanolitres de chaque dilution d’endothiapepsine dans les sous-puits un et deux du crible. Multi-aspirer 50 nanolitres de stock de graines décongelées et 100 nanolitres de la solution de puits du sous-puits deux et distribuer les deux dans la solution protéique.
Mélanger les solutions trois fois après l’ajout du tampon de cristallisation ou du tampon de cristallisation et du mélange de graines. Maintenant, scellez la plaque et l’image à zéro, trois, six, 12, 18 et 24 heures du premier jour tous les jours pendant la première semaine et chaque semaine pendant les quatre semaines suivantes à 20 degrés Celsius. Après 24 heures, regardez la plaque au microscope, estimez le nombre de cristaux dans chaque puits et mesurez un échantillon des cristaux.
Notez ces estimations dans la feuille de travail du générateur de morphogramme fournie. Entrez les concentrations initiales d’endothiapepsine et de PEG 6000 dans les cases appropriées. La feuille de calcul tracera automatiquement les résultats dans le format traditionnel du diagramme de phase avec les concentrations de précipitant et de protéines sur les axes X et Y respectivement.
Les conditions de puits qui ne donnent lieu qu’à des cristaux dans leurs gouttes ensemencées indiquent la région métastable du diagramme, tandis que les conditions avec des cristaux dans les gouttes ensemencées et non ensemencées indiquent la zone de nucléation. À partir de l’analyse morphogramme, sélectionnez la condition la plus prometteuse pour la mise à l’échelle en plaques de 24 puits. Ensuite, commencez avec 100 milligrammes par millilitre d’endothiapepsine et 35% PEG 6000.
Préparer cinq millilitres de tampon de cristallisation avec 35% PEG 6000, 0,1 molaire Tris-HCl avec pH sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium. Placez maintenant 0,5 millilitre du tampon de cristallisation dans trois puits d’une plaque de goutte suspendue graissée de 24 puits. Mélanger 15 microlitres d’endothiapepsine avec 15 microlitres de solution de cristallisation sur un couvercle en verre.
Placez la solution sur les puits et laissez la plaque pendant 24 heures. Après 24 heures, regardez la plaque au microscope, estimez le nombre de cristaux dans la goutte et mesurez leur taille. Si les cristaux sont incorrects, répétez cette étape, mais modifiez la concentration en protéines ou ajoutez des graines si la nucléation cristalline n’est pas assez élevée.
Répétez l’expérience de mise à l’échelle de 24 puits en ajoutant des graines à une concentration plus élevée de PEG 6000. Placez 0,5 millilitre du nouveau tampon de cristallisation dans trois puits d’une plaque de goutte suspendue graissée de 24 puits. Placez 15 microlitres d’endothiapepsine sur un couvercle en verre et mélangez cinq microlitres de stock de graines et 10 microlitres de solution de cristallisation avec la solution d’endothiapepsine.
Inversez les feuillets de couverture, placez-les au-dessus des puits et laissez-les reposer pendant 24 heures. Revérifiez les gouttes pour voir si les cristaux sont plus petits et ont une concentration plus élevée. Estimez le nombre de cristaux dans la goutte et mesurez à nouveau leur taille pour voir s’ils sont maintenant de la bonne taille.
Pour effectuer un protocole de lot ensemencé, préparez le tampon de cristallisation de 40% PEG 6000, 0,1 molaire Tris-HCl avec un pH de sept et 0,15 molaire de chlorure de magnésium. Prémélangez 50 microlitres de stock de graines et 100 microlitres de solution de cristallisation, et mélangez avec une solution protéique dans le tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Tourbillonnez le tube pendant 10 secondes et placez-le sur une bascule ou un shaker à 20 degrés Celsius.
Prendre une partie aliquote de 2,5 microlitres de la solution discontinue toutes les 20 minutes. Surveillez la taille et le nombre de cristaux à l’aide d’un hémocytomètre. Comptez le nombre de cristaux et mesurez leur taille au microscope.
Lorsque les cristaux ont atteint une dimension d’environ 15 microns, éteignez la réaction avec 150 microlitres d’acétate de sodium 0,5 molaire supplémenté avec 0,5 molaire de Tris-HCl, 0,075 molaire de chlorure de magnésium et 20% de PEG 6000. Vérifiez à nouveau la taille et la concentration des cristaux à l’aide de l’hémocytomètre. Conservez les cristaux à 20 degrés Celsius.
L’analyse morphogramme de l’endothiapepsine a suggéré que la nucléation était influencée à la fois par les concentrations de protéines et de précipitants. Les régions MetaStable, de nucléation et de précipitation du diagramme peuvent être bien distinguées. L’ajout de graines a considérablement augmenté le nombre de cristaux par rapport aux gouttes sans graines.
L’analyse de la microcristallisation de l’endothiapepsine dans des volumes de 200 à 300 microlitres a révélé les changements dans la nucléation des cristaux et la dimension la plus longue au fil du temps. L’augmentation de la concentration de PEG à 35% a nettement amélioré la cristallisation, avec une concentration finale de cristaux d’environ 3,6 fois 10 à six par millilitre, et la plus longue dimension cristalline de 42 micromètres. Pour réduire la taille des cristaux finaux, une approche de réduction de la concentration en protéines a été appliquée, ce qui a malheureusement réduit considérablement la concentration en cristaux et a finalement produit des cristaux encore plus gros.
Cependant, l’approche consistant à augmenter la concentration de PEG à 40% a donné des cristaux environ 3,1 fois 10 à six par millilitre et une taille d’environ 39 micromètres. En outre, l’ajout de graines a entraîné une augmentation significative de la concentration en cristaux, environ 1,1 fois 10 à huit par millilitre et des dimensions plus petites d’environ 4,2 micromètres. L’effet de trempe tenté dans la réaction de cristallisation a donné une concentration cristalline finale d’environ 2,6 fois 10 à six par millilitre et une taille d’environ 15 micromètres.
La moitié CC tracée par rapport à la résolution des données radiographiques a montré une légère diminution de la résolution des cristaux de 10 microlitres à 200 à 300 microlitres. Cependant, le cristal s’est toujours diffracté à 1,5 angstrum, ce qui a été jugé suffisant. L’endothiapepsine est une protéine indulgente avec laquelle travailler.
Nous espérons qu’essayer ce protocole d’endothiapepsine générera des idées et des méthodes utiles pour d’autres protéines. En particulier avec la cristallographie, il est bénéfique de voir à quoi ressemblent les choses plutôt que d’essayer de suivre uniquement un protocole écrit. J’espère que cette vidéo vous donnera une partie de cette sensation.
