ניסויי קריסטלוגרפיה סדרתיים יכולים להיות מאתגרים. משוכה מרכזית בפרקטיקה שלהם היא יצירת דגימות מיקרוקריסטליניות. פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן ליצור דגימות כאלה באופן אמין.
שיטה זו משתמשת באנדותיאפפסין כדי לתת מסגרת לאופטימיזציה של גבישים גדולים הגדלים בלוחות דיפוזיה של אדים בנפח קטן לתרחיפים מיקרוקריסטלינים בנפח גדול. איננו יכולים לטעון שפרוטוקול זה יצליח באופן אוניברסלי. עם זאת, אנו מקווים שהרעיונות והשיטות המוצעים כאן יעניקו לאחרים מסגרת ניסויית להשתמש בה על חלבונים אחרים.
כדי להתחיל, להכין צלחת שתי טיפות 96 באר עם חיץ התגבשות באמצעות הרובוט Formulatrix. באמצעות תערובת רובוטים לטיפול בנוזל, ערבבו 150 ננוליטר של אנדותיאפפסין שזה עתה הופשר עם 150 ננוליטר של חיץ ההתגבשות בכל באר. אטמו את הצלחת ואפשרו לגבישים לגדול במשך 24 שעות בתוך מלון פורמולטריקס.
לאחר 24 שעות, לפרק ולהסיר את הגבישים מחמש בארות של צלחת התגבשות 96 בארות. הניחו אותם ב-250 מיקרוליטר של חיץ ההתגבשות בצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר הממוקם בדלי קרח. הוסף 10 עד 15 חרוזי זכוכית בגודל מילימטר אחד לתוך צינור הצנטריפוגה.
מערבלים את הגבישים והחרוזים ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות, ומחליפים אותם על קרח למשך 30 שניות. לאחר מכן ניתן להשתמש בזרעים מיד או לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע ניסוי מורפוגמה, הוסף ריכוזים של חמישה עד 40% של PEG 6000 עם Tris-HCl טוחנת אחת ב- pH שבע ו- 0.15 מגנזיום כלורי מולארי לאורך עמודות הצלחת של מסך רשת בן שתי טיפות 96 בארות תקן דילול רציף של אנדותיאפפסין בנתרן אצטט מולארי 0.1 מ -100 עד 12.5 מיליגרם למיליליטר במשך שמונה צעדים.
לאחר מכן פיפטה שמונה מיקרוליטרים מכל דילול ואחריה שני מיקרוליטרים של מלאי זרעים לתוך צלחת הרובוט לטיפול בנוזל. באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים, יש לפזר 150 ננוליטר מכל דילול של אנדותיאפפסין לבארות משנה אחת ושתיים של המסך. יש לשאוף 50 ננוליטר של מלאי זרעים מופשר ו-100 ננוליטר של תמיסת הבאר מתת-באר שתיים ולחלק את שניהם לתמיסת החלבון.
מערבבים תמיסות שלוש פעמים עם הוספת חיץ ההתגבשות או חיץ ההתגבשות ותערובת הזרעים. כעת אטמו את הצלחת והתמונה באפס, שלוש, שש, 12, 18 ו-24 שעות של היום הראשון בכל יום בשבוע הראשון ובכל שבוע במשך ארבעת השבועות הבאים ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, התבוננו בצלחת תחת מיקרוסקופ, העריכו את מספר הגבישים בתוך כל באר ומדדו דגימה של הגבישים.
רשום הערכות אלה בגליון העבודה שסופק מחולל מורפוגרמות. הזן את הריכוזים ההתחלתיים של endothiapepsin ו- PEG 6000 בתיבות המתאימות. גליון העבודה יתווה באופן אוטומטי את התוצאות בתבנית דיאגרמת הפאזה המסורתית עם ריכוזי המשקע והחלבון בציר X ו- Y בהתאמה.
ובכן, תנאים המולידים גבישים רק בטיפות הזרעים שלהם מצביעים על אזור המטא-יציב של הדיאגרמה, בעוד שתנאים עם גבישים הן בטיפות הזרעים והן בטיפות שאינן זרעים מציינים את אזור הגרעין. מניתוח המורפוגרמה, בחר את התנאי המבטיח ביותר לשינוי קנה מידה ל -24 לוחות באר. לאחר מכן להתחיל עם 100 מיליגרם למיליליטר של endothiapepsin ו 35% PEG 6000.
הכינו חמישה מיליליטר של חיץ התגבשות עם 35% PEG 6000, 0.1 Tris-HCl טוחנת עם pH שבע ו-0.15 מגנזיום כלורי טוחן. כעת מניחים 0.5 מיליליטר של חיץ ההתגבשות בשלוש בארות של צלחת טיפה תלויה משומנת של 24 בארות. מערבבים 15 מיקרוליטר של אנדותיאפפסין עם 15 מיקרוליטר של תמיסת התגבשות על משטח זכוכית.
מניחים את הפתרון מעל הבארות ומשאירים את הצלחת למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, התבוננו בצלחת תחת מיקרוסקופ, העריכו את מספר הגבישים בטיפה ומדדו את גודלם. אם הגבישים שגויים, חזרו על שלב זה, אך שנו את ריכוז החלבונים או הוסיפו זרעים אם הגרעין הגבישי אינו גבוה מספיק.
חזור על ניסוי קנה המידה של 24 בארות על ידי הוספת זרעים בריכוז גבוה יותר של PEG 6000. מניחים 0.5 מיליליטר של חיץ ההתגבשות החדש בשלוש בארות של צלחת טיפה תלויה משומנת של 24 בארות. הניחו 15 מיקרוליטר של אנדותיאפפסין על מכסה זכוכית, החליקו וערבבו חמישה מיקרוליטרים של ציר זרעים ו-10 מיקרוליטר של תמיסת התגבשות עם תמיסת אנדותיאפפסין.
הפכו את פתקי הכיסוי, הניחו אותם מעל הבארות והשאירו למשך 24 שעות. בדוק שוב את הטיפות כדי לראות אם הגבישים קטנים יותר ויש להם ריכוז גבוה יותר. הערך את מספר הגבישים בטיפה ומדוד שוב את גודלם כדי לראות אם הם כעת בגודל הנכון.
כדי לבצע פרוטוקול אצווה זרעים, הכינו את חיץ ההתגבשות של 40%PEG 6000, 0.1 Tris-HCl מולארי עם pH של שבע, ו-0.15 מגנזיום כלורי טוחן. ערבבו מראש 50 מיקרוליטר מלאי זרעים ו-100 מיקרוליטר תמיסת התגבשות, וערבבו עם תמיסת חלבון בצינור הצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. סובבו את הצינור למשך 10 שניות והניחו אותו על נדנדה או שייקר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
קח aliquot 2.5 מיקרוליטר של פתרון אצווה כל 20 דקות. עקוב אחר גודל ומספר הגבישים באמצעות המוציטומטר. ספרו את מספר הגבישים ומדדו את גודלם תחת המיקרוסקופ.
כאשר הגבישים הגיעו לממד של כ-15 מיקרון, הרוו את התגובה עם 150 מיקרוליטר של נתרן אצטט מולארי 0.5 בתוספת 0.5 טריס-HCl טוחן, 0.075 מגנזיום כלורי מולארי ו-20% PEG 6000. בדוק שוב את גודל הגביש וריכוזו באמצעות ההמוציטומטר. אחסנו את הגבישים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
ניתוח מורפוגרמת אנדותיאפפסין הציע כי נוקלציה הושפעה הן מריכוזי חלבונים והן מריכוזי מזרזים. ניתן להבחין יפה בין אזורי MetaStable, נוקלציה ומשקעים של הדיאגרמה. תוספת הזרעים הגדילה משמעותית את מספר הגבישים בהשוואה לטיפות ללא זרעים.
ניתוח של התגבשות מיקרו אנדותיאפפסין בנפחים של 200 עד 300 מיקרוליטר חשף את השינויים בגרעין הגביש ואת הממד הארוך ביותר לאורך זמן. הגדלת ריכוז ה-PEG ל-35% שיפרה משמעותית את ההתגבשות, עם ריכוז גבישי סופי של בערך פי 3.6 פי 10 עד שש למיליליטר, וממד הגביש הארוך ביותר של 42 מיקרומטר. כדי להקטין את גודל הגבישים הסופיים, יושמה גישה להפחתת ריכוז החלבון, שלמרבה הצער הפחיתה את ריכוז הגביש באופן משמעותי, ובסופו של דבר יצרה גבישים גדולים עוד יותר.
עם זאת, הגישה של הגדלת ריכוז ה-PEG ל-40% הניבה גבישים בערך פי 3.1 פי 10 עד שישה למיליליטר וגודל של כ-39 מיקרומטר. יתר על כן, הוספת זרעים הובילה לעלייה משמעותית בריכוז הגביש, בסביבות פי 1.1 פי 10 לשמונה למיליליטר וממדים קטנים יותר של כ -4.2 מיקרומטר. אפקט המרווה שניסה בתגובת ההתגבשות נתן ריכוז גבישי סופי של כ-2.6 כפול 10 עד שש למיליליטר וגודל של כ-15 מיקרומטר.
חצי CC שזוהה כנגד הרזולוציה מנתוני קרני הרנטגן הראה ירידה קלה ברזולוציית הגביש מנפח של 10 מיקרוליטר לנפח של 200 עד 300 מיקרוליטר. עם זאת, הגביש עדיין התפזר ל -1.5 אנגסטרום, אשר נחשב מספיק. אנדותיאפפסין הוא חלבון סלחני לעבוד איתו.
אנו מקווים כי ניסיון פרוטוקול זה של endothiapepsin ייצור רעיונות שימושיים ושיטות עבור חלבונים אחרים. במיוחד עם קריסטלוגרפיה, זה מועיל לראות איך הדברים נראים ומרגישים במקום לנסות רק לעקוב אחר פרוטוקול כתוב. יש לקוות שהסרטון הזה ייתן לכם חלק מהתחושה הזו.
