Gli esperimenti di cristallografia seriale possono essere impegnativi. Un ostacolo chiave nella loro pratica è la creazione di campioni microcristallini. Questo protocollo mostra come tali campioni possono essere creati in modo affidabile.
Questo metodo utilizza l'endotiapepsina per fornire un quadro per ottimizzare i cristalli di grandi dimensioni cresciuti in piastre di diffusione del vapore di piccolo volume in fanghi microcristallini di grande volume. Non possiamo pretendere che questo protocollo avrà un successo universale. Tuttavia, speriamo che le idee e i metodi proposti qui forniscano ad altri un quadro sperimentale da impiegare su altre proteine.
Per iniziare, preparare una piastra a due gocce da 96 pozzetti con il tampone di cristallizzazione utilizzando il robot Formulatrix. Utilizzando una miscela robotica per la gestione dei liquidi, mescolare 150 nanolitri di endotiapepsina appena scongelata con 150 nanolitri del tampone di cristallizzazione in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e lasciare crescere i cristalli per 24 ore all'interno del Formulatrix Hotel.
Dopo 24 ore, rompere e rimuovere i cristalli da cinque pozzetti della piastra di cristallizzazione a 96 pozzetti. Metterli in 250 microlitri del tampone di cristallizzazione in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri posto in un secchiello del ghiaccio. Aggiungere da 10 a 15 perle di vetro di un millimetro nel tubo della centrifuga.
Vortice i cristalli e le perle a 1000 RPM per 30 secondi e sostituirli sul ghiaccio per 30 secondi. I semi possono quindi essere utilizzati immediatamente o conservati a meno 20 gradi Celsius. Per eseguire un esperimento di morfogramma, aggiungere da cinque al 40% concentrazioni di PEG 6000 con un molare Tris-HCl a pH sette e 0,15 molari di cloruro di magnesio lungo le colonne della piastra di uno schermo a griglia a 96 pozzetti a due gocce Riparare una diluizione sequenziale di endotiapepsina in acetato di sodio molare 0,1 da 100 a 12,5 milligrammi per millilitro in otto fasi.
Quindi pipettare otto microlitri di ogni diluizione seguiti da due microlitri di materiale di semi nella piastra del robot di movimentazione dei liquidi. Utilizzando un robot per la gestione dei liquidi, erogare 150 nanolitri di ogni diluizione di endotiapepsina nei sottopozzetti uno e due dello schermo. Multi-aspirare 50 nanolitri di ceppo di semi scongelati e 100 nanolitri della soluzione del pozzetto dal sottopozzetto due e erogare entrambi nella soluzione proteica.
Mescolare le soluzioni tre volte dopo l'aggiunta del tampone di cristallizzazione o del tampone di cristallizzazione e della miscela di semi. Ora sigilla la piastra e l'immagine a zero, tre, sei, 12, 18 e 24 ore del primo giorno ogni giorno per la prima settimana e ogni settimana per le prossime quattro settimane a 20 gradi Celsius. Dopo 24 ore, guardare la piastra al microscopio, stimare il numero di cristalli all'interno di ciascun pozzetto e misurare un campione dei cristalli.
Registrare queste stime nel foglio di lavoro del generatore di morfogrammi fornito. Inserire le concentrazioni iniziali di endotiapepsina e PEG 6000 nelle apposite scatole. Il foglio di lavoro traccerà automaticamente i risultati nel formato tradizionale del diagramma di fase con le concentrazioni di precipitante e proteine rispettivamente sull'asse X e Y.
Le condizioni di pozzo che danno origine solo a cristalli nelle loro gocce seminate indicano la regione MetaStable del diagramma, mentre le condizioni con cristalli sia nelle gocce seminate che in quelle non seminate indicano la zona di nucleazione. Dall'analisi del morfogramma, selezionare la condizione più promettente per il ridimensionamento in 24 piastre di pozzetto. Quindi iniziare con 100 milligrammi per millilitro di endotiapepsina e 35% PEG 6000.
Preparare cinque millilitri di tampone di cristallizzazione con 35% PEG 6000, 0,1 molare Tris-HCl con pH sette e 0,15 molare cloruro di magnesio. Ora posizionare 0,5 millilitri del tampone di cristallizzazione in tre pozzetti di una piastra a goccia appesa a 24 pozzetti unta. Mescolare 15 microlitri di endotiapepsina con 15 microlitri di soluzione di cristallizzazione su un vetrino di copertura.
Posizionare la soluzione sopra i pozzetti e lasciare la piastra per 24 ore. Dopo 24 ore, guarda la lastra al microscopio, stima il numero di cristalli nella goccia e misura le loro dimensioni. Se i cristalli non sono corretti, ripetere questo passaggio, ma modificare la concentrazione proteica o aggiungere semi se la nucleazione dei cristalli non è abbastanza alta.
Ripetere l'esperimento di ridimensionamento a 24 pozzetti aggiungendo semi a una concentrazione più elevata di PEG 6000. Posizionare 0,5 millilitri del nuovo tampone di cristallizzazione in tre pozzetti di una piastra a goccia ingrassata a 24 pozzetti. Porre 15 microlitri di endotiapepsina su un vetrino di copertura e mescolare cinque microlitri di seme e 10 microlitri di soluzione di cristallizzazione con la soluzione di endotiapepsina.
Capovolgere i vetrini di copertura, posizionarli sopra i pozzetti e lasciare per 24 ore. Ricontrolla le gocce per vedere se i cristalli sono più piccoli e hanno una concentrazione più alta. Stimare il numero di cristalli nella goccia e misurare di nuovo la loro dimensione per vedere se ora sono della dimensione corretta.
Per eseguire un protocollo seeded-batch, preparare il tampone di cristallizzazione del 40% PEG 6000, 0,1 molari Tris-HCl con un pH di sette e 0,15 molari di cloruro di magnesio. Premiscelare 50 microlitri di seme e 100 microlitri di soluzione di cristallizzazione e mescolare con soluzione proteica nella provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo per 10 secondi e posizionarlo su un bilanciere o uno shaker a 20 gradi Celsius.
Assumere un'aliquota da 2,5 microlitri della soluzione batch ogni 20 minuti. Monitorare la dimensione e il numero dei cristalli utilizzando un emocitometro. Conta il numero di cristalli e misura la loro dimensione al microscopio.
Quando i cristalli hanno raggiunto una dimensione di circa 15 micron, estinguere la reazione con 150 microlitri di acetato di sodio 0,5 molare integrato con Tris-HCl da 0,5 molari, cloruro di magnesio 0,075 molare e 6000 PEG al 20%. Ricontrollare la dimensione e la concentrazione del cristallo utilizzando l'emocitometro. Conservare i cristalli a 20 gradi Celsius.
L'analisi del morfogramma dell'endotiapepsina ha suggerito che la nucleazione era influenzata sia dalle concentrazioni proteiche che da quelle dei precipitanti. Le regioni MetaStable, nucleazione e precipitazione del diagramma possono essere ben distinte. L'aggiunta di semi ha aumentato significativamente il numero di cristalli rispetto alle gocce senza semi.
L'analisi della microcristallizzazione dell'endotiapepsina in volumi da 200 a 300 microlitri ha rivelato i cambiamenti nella nucleazione dei cristalli e la dimensione più lunga nel tempo. L'aumento della concentrazione di PEG al 35% ha notevolmente migliorato la cristallizzazione, con una concentrazione finale di cristalli di circa 3,6 volte 10 al sei per millilitro e la dimensione del cristallo più lunga di 42 micrometri. Per ridurre le dimensioni dei cristalli finali, è stato applicato un approccio di riduzione della concentrazione proteica, che purtroppo ha ridotto significativamente la concentrazione di cristalli e alla fine ha prodotto cristalli ancora più grandi.
Tuttavia, l'approccio di aumentare la concentrazione di PEG al 40% ha prodotto cristalli circa 3,1 volte 10 al sei per millilitro e una dimensione di circa 39 micrometri. Inoltre, l'aggiunta di semi ha portato ad un aumento significativo della concentrazione di cristalli, circa 1,1 volte 10 all'otto per millilitro e dimensioni più piccole di circa 4,2 micrometri. L'effetto di spegnimento tentato nella reazione di cristallizzazione ha dato una concentrazione finale di cristalli di circa 2,6 volte 10 al sei per millilitro e una dimensione di circa 15 micrometri.
La metà CC tracciata rispetto alla risoluzione dei dati a raggi X ha mostrato una leggera diminuzione della risoluzione dei cristalli dai volumi da 10 microlitri a 200-300 microlitri. Tuttavia, il cristallo era ancora diffratto a 1,5 angstrum, che è stato ritenuto sufficiente. L'endotiapepsina è una proteina indulgente con cui lavorare.
Speriamo che provare questo protocollo di endotiapepsina generi idee e metodi utili per altre proteine. In particolare con la cristallografia, è utile vedere come appaiono e si sentono le cose piuttosto che cercare di seguire solo un protocollo scritto. Si spera che questo video ti dia un po 'di quella sensazione.
