Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.

1. Puffervorbereitung
<ol><li>Für 500 ml 2x PHEM-Puffer 18,14 g Piperazin-N,N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), 3,8 g Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,99 g Magnesiumsulfat (MgSO4) kombinieren Machen Sie das Volumen bis zu 400 ml mit destilliertem Wasser (dH2O), rühren sie und stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,0 ein. Machen Sie das Endvolumen bis zu 500 ml, und dann in 50 ml Aliquots aufgeteilt. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich. HINWEIS: Der Puffer ist erst klar, wenn der pH-Wert 7,0 erreicht.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lagerlösung von 37% w/v Paraformaldehyd (PFA) vor. Für 50 ml 18,5 g PFA und 35 ml dH2O in einer Glasflasche mischen. Legen Sie die Flasche auf einen Magnetischen Rührer mit Heizung. Fügen Sie 900 L von 1 M KOH oder NaOH hinzu und rühren Sie, bis die Lösung klar wird. Abkühlen lassen und in ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr geben; aufladen bis zu 50 ml mit dH2O. Die Lösung kann bei -20 °C gelagert werden, bis erforderlich. HINWEIS: Formaldehyd sollte in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, während Schutzhandschuhe und ein Labormantel getragen werden.</li>
	<li>Vorbereiten des Fixationspuffers (3,7 % PFA gepuffert mit PHEM). Für 50 ml 5 ml 5 ml 37% PFA-Lösung, 25 ml 2x PHEM-Puffer und 20 ml dH2O in einem 50 ml konischen Zentrifugenrohr kombinieren. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich. HINWEIS: Nach dem Auftauen kann der Puffer bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>PBST vorbereiten (0,1% Tween-20 in 1x Phosphat-gepufferter Saline [PBS]). Für 50 ml 50 l von 100 % Tween-20 bis 50 ml 1x PBS hinzufügen und gut mischen. HINWEIS: Die Lösung kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Rehydrierungspuffer vor, indem Sie MeOH/PBST in Verhältnissen von 3:1, 1:1 und 1:3 kombinieren (Endvolumen von jeweils 100 ml; siehe Tabelle 1). HINWEIS: MeOH ist sehr giftig und brennbar. Da es den Sehnerv beschädigen kann, sollte es in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, um offene Flammen zu vermeiden. Da das Mischen von MeOH und PBST eine exotherme Reaktion erzeugt, kombinieren Sie die Lösungen auf Eis.</li>
	<li>Für 1000 ml 20x SSC 175,3 g Natriumchlorid (NaCl) und 88,2 g Natriumcitrat in einem Becher glasieren und mit 800 ml dH2O. rühren, bis es gelöst ist, und den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 einstellen. Fügen Sie dH2O zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml hinzu und autoklavieren oder filtern Sie durch einen 0,22 m Filter in eine autoklavierte Flasche.</li>
	<li>Für 50 ml 5x SSCT 12,5 ml 20x SSC-Puffer mit 37,5 ml dH2O kombinieren und 50 l von 100% Tween-20 hinzufügen. Gut mischen.</li>
	<li>Für 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, kombinieren 25 ml 5x SSCT mit 25 ml PBST.</li>
	<li>Für 50 ml 2x SSC 5 ml 10x SSC Puffer mit 45 ml dH2O mischen gut kombinieren. HINWEIS: Alle SSC-Puffer sollten bei RT im Dunkeln gespeichert werden.</li>
</ol>2. Zieldefinition, Sonden und Verstärker
<ol><li>Verwenden Sie die auf der Website des Herstellers verfügbaren Tools, um Verstärker und Sonden zu entwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Sonden den umgekehrten DNA-Strang des SARS-CoV-2 N-Gens ergänzen (Ergänzende Abbildung 1).</li>
	<li>Bestimmen Sie die beste Sondensatzgröße (ein Satz von 20 Prüfstons ist für die Visualisierung ausreichend).</li>
	<li>Stellen Sie die Verstärker ein, die für die Ziel-RNA-Erkennung verwendet werden.<ol>
<li>Verwenden Sie den HCR-Verstärker B1 mit Alexa Fluor 647 beschriftet. HINWEIS: Ein HCR-Verstärker besteht aus metastabilen HCR-Haarnadeln h1 und h2. Multiplex-Experimente können mit diesem Protokoll entwickelt werden. Wenn dies geplant ist, wählen Sie einen anderen HCR-Verstärker (B1, B2, ...) für jede Ziel-RNA, die innerhalb derselben Probe abgebildet werden soll (z. B. Verstärker B1 für Ziel 1, Verstärker B2 für Ziel 2, ...).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Zellkultur und Infektion mit SARS-CoV-2
<ol><li>Kultur Vero (Affennierenepithelzellen) Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 5% fetales Rinderserum enthält.<ol>
<li>Säen Sie 50.000 Zellen auf Deckscheiben (Nr. 1, 15 × 15 mm) in einer 12-Well-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie vollständig differenzierte HAE-Kulturen wie beschrieben18 auf durchlässigen Transwell-Insert-Stützen mit einer Membran (Durchmesser = 6,5 mm) und Kultur in bronchialen epithelialen Wachstumsmedium bis vollständig konfluent.</li>
	<li>Virusinfektion<ol>
<li>Impfzellen mit SARS-CoV-2 bei 1000x mittlerer Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID50) pro ml</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen für 2 h bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, um ungebundene Viren zu entfernen.</li>
		<li>Kulturzellen für 48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero-Zellen auf Deckellips kultiviert
TAG 1
<ol><li>Fixierung und Permeabilisierung von Zellen<ol>
<li>Fix infizierte Zellen mit 3.7% w/v PFA-Lösung für 1 h bei RT.</li>
		<li>Saugen Sie die 3,7% PFA-Lösung an und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
		<li>Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBST-Lösung für 10 min bei RT mit Agitation.</li>
		<li>Aspirieren Sie die PBST, und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Erkennung<ol>
<li>Die 1x PBS-Lösung aspirieren und die Zellen zweimal mit 2x SSC bei RT waschen.</li>
		<li>Aspirieren Sie die 2x SSC-Lösung, und prähybridisieren Sie die Samples, indem Sie mindestens 300 L Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen. Bedecken Sie die Brunnen, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min.</li>
		<li>Bereiten Sie die Sondenlösung vor, indem Sie dem Sondenhybridisierungspuffer 1,2 pmol Sondenmischung hinzufügen.<ol>
<li>Verwenden Sie 1,2 l des 1-M-Sondenbestands, um 300 L Arbeitsbestand vorzubereiten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung, und übertragen Sie die Abdeckungen in eine befeuchtete Kammer.<ol>
<li>Pipette 30-50 l der Sondenlösung auf Parafilm, um einzelne Tröpfchen zu bilden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei 37 °C. TAG 2</li>
		<li>Die Abdeckungen wieder in eine 12-Well-Platte geben und überschüssige Sondenlösung entfernen, indem Sie 4 x 5 min mit 400 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen. ANMERKUNG: Als Alternative zur Platzierung von 30-50 l Aliquots auf Parafilm und unter Deckscheiben für die Inkubation, fügen Sie 300 l Sondenlösung direkt zu Denlips in einer 12-Well-Platte hinzu. Dieses Verfahren ist einfacher, erfordert aber erhebliche Mengen an Reagenzien. Den Sondenwaschpuffer vor Gebrauch auf 37 °C erhitzen. Berechnen Sie die benötigte Puffermenge, und übertragen Sie sie in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr.</li>
		<li>Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT waschen.</li>
		<li>Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.</li>
	</ol></li>
	<li>Verstärkung<ol>
<li>Entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen, und fügen Sie jedem Bohrspeicher mindestens 300 L Verstärkungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT.</li>
		<li>Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel (h1 und h2) vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Rohren abkühlen.<ol>
<li>Um 300 l Amplifikationslösung vorzubereiten, verwenden Sie 18 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 300 l, verwenden Sie 6 l einer 3-M-Stammhaarnadellösung).</li>
			<li>Übertragen Sie die Haarnadellösung in Tuben.</li>
			<li>Bei 95 °C für 90 s inkubieren.</li>
			<li>Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie dem Amplifikationspuffer die snap-gekühlten Haarnadeln "h1" und "h2" hinzufügen.</li>
		<li>Tropfen von 30-50 l Haarnadelmischung auf Parafilm legen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) im Dunkeln bei RT. TAG 3</li>
		<li>Übertragen Sie die Abdeckungen zurück in die 12 Well Platte, und entfernen Sie überschüssige Haarnadeln durch Waschen für 5 x 5 min mit 5x SSCT bei RT mit Rührung.</li>
		<li>Aspirieren Sie den 5x SSCT-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 1x PBS. HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von der Färbung von Kernen (siehe Abschnitt 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Nukleare Färbung und Gleitmontage<ol>
<li>Die 1x PBS-Lösung aspirieren und in 1x PBS-Lösung durch 4x,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 0,2 g/ml) ersetzen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.</li>
		<li>Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
		<li>Legen Sie zwei Tropfen von je 10 L DesMontagemedium; Stellen Sie sicher, dass die Tropfen so weit voneinander getrennt sind, dass zwei Abdeckungen auf einem einzigen Dia platziert werden können.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Abdeckungen auf ein sauberes Handtuch tippen, und legen Sie sie dann in Antifade-Montagemedium mit den Zellen nach unten.</li>
		<li>Die montierten Proben auf eine trockene, flache Oberfläche im Dunkeln stellen und aushärten lassen.</li>
		<li>Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.</li>
	</ol></li>
</ol>5. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE-Kulturen
TAG 1
<ol start="1"><li>Fixierung und Durchlässigkeit der HAE-Kultur<ol>
<li>Aspirieren Sie das Medium, und fixieren Sie die infizierten Zellen mit 3,7% PFA-Lösung für 1 h bei RT.</li>
		<li>Die 3,7%-PFA-Lösung ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen.<ol>
<li>Ersetzen Sie die 3,7% PFA-Lösung durch 1x PBS unter einem Transwell-Einsatz.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entsorgen Sie die PBS, und dehydrieren Sie die Proben mit 2 x 5 min Wähwürn mit 100% MeOH vorgekühlt auf -20 °C.</li>
		<li>Nach der zweiten Wäsche den Puffer durch frisches, gekühltes MeOH zur Permeabilisierung unter dem Transwell-Einsatz ersetzen. Über Nacht bei -20 °C lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>TAG 2
<ol start="2"><li>Rehydration Rehydratisieren Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von MeOH/PBST-Lösungen (jeweils für 5 min) auf Eis: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS und 100% PBST (zweimal).<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen für 5 min auf Eis mit 50% 5x SSCT/50% PBST.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen für 5 min auf Eis mit 5x SSCT.</li>
		<li>Ersetzen Sie den 5x SSCT-Puffer durch 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkennung<ol>
<li>Inkubieren Sie die Zellen (innerhalb des Transwell-Einsatzes) für 5 min auf Eis mit 100 l Sondenhybridisierungspuffer. Als nächstes übertragen Sie die Platte für 30 min bei 37 °C (Vorhybridisierung) in den Inkubator. HINWEIS: Der Sondenhybridisierungspuffer muss vor Gebrauch auf 37 °C vorgeheizt werden. Berechnen Sie das benötigte Volumen: Für einen einzelnen Transwell-Einsatz werden 100 l benötigt.</li>
		<li>Bereiten Sie die Prüfpunktlösung vor. Da 1 ml Sondenlösung 4 pmol Sonde benötigt, 4 L von 1 'M Sondenlagerlösung zu 1 ml Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen und gut mischen. HINWEIS: Für die RNA-Erkennung verwenden Sie 100 L Sondenlösung pro Transwell-Einsatz. Lassen Sie die Sondenlösung bis zum Ende des Vorhybridisierungsschritts auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung, und fügen Sie die Prüfpunktlösung hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (12-18 h) bei 37 °C. TAG 3</li>
		<li>Überschüssige Sonde entfernen, indem Sie 4 x 15 min mit 100 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT.</li>
		<li>Ersetzen Sie den 5x SSCT durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verstärkung<ol>
<li>Präamplify die Proben durch Inkubation mit Verstärkungspuffer für 30 min bei RT.</li>
		<li>Bereiten Sie jede Haarnadel vor, indem Sie die gewünschten Volumina in separaten Rohren abkühlen.<ol>
<li>Um eine Amplifikationslösung von 500 l zu erstellen, verwenden Sie 30 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 500 l, 10 l von 3 'M Stammhaarnadellösung).</li>
			<li>Übertragen Sie die Haarnadellösung in die Schläuche.</li>
			<li>Bei 95 °C für 90 s inkubieren.</li>
			<li>Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie die Haarnadellösung vor, indem Sie alle snap-cooled Haarnadeln zu 500 l Verstärkungspuffer bei RT hinzufügen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Vorverstärkungslösung, und fügen Sie die komplette Haarnadellösung hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei RT im Dunkeln.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie mit 5x SSCT bei RT wie folgt waschen: 2 x 5 min, 2 x 15 min und 1 x 5 min.</li>
		<li>Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie sie bei 4 °C für nicht mehr als 2-3 Tage oder gehen Sie direkt zur nuklearen Färbung über. HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von nuklearer Färbung (siehe Abschnitt 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nukleare Färbung und Gleitmontage<ol>
<li>Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine DAPI-Lösung (0,2 g/ml) in 1x PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.</li>
		<li>Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
		<li>Legen Sie die Ausgeschnittenmembran der Transwell-Einsätze auf 10 l Antifade-Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches Montagemedium (5 l) hinzu.</li>
		<li>Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.</li>
		<li>Härten Sie die montierten Proben auf einer trockenen, flachen Oberfläche im Dunkeln.</li>
		<li>Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Immunfluoreszenzanalyse von Vero-Zellen und HAE-Kulturen
HINWEIS: Führen Sie den Immunfluoreszenztest am 3. Tag für Zelllinien oder Tag 4 für HAE-Kulturen durch. Verwenden Sie für jedes Modell einen anderen Ansatz. Alle Unterschiede sind deutlich gekennzeichnet.
<ol><li>Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Proben durch Inkubation mit 1% w/v Rinderserumalbumin in PBST-Lösung für 30 min bei 37 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie primäre Antikörper vor, indem Sie geeignete Verdünnungen in der Blockierlösung vorbereiten und inkubieren.<ol>
<li>Für Vero-Zellen auf Abdeckungen:<ol>
<li>Tropfen (30-50 l) der Antikörperlösung auf Parafilm in eine Feuchtigkeitskammer geben.</li>
			<li>Legen Sie Coverlips auf die Antikörpertropfen mit nach unten gerichteten Zellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ersetzen Sie bei HAE das Blockiermittel in den Einsätzen durch eine Antikörperlösung (100 l), und inkubieren Sie die Proben in einer befeuchteten Kammer. HINWEIS: Passen Sie die Zeit und Temperatur für jede Inkubation mit primärem Antikörper an. Typische Parameter sind 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit PBST.<ol>
<li>Für Zellen auf Deckellipse auf eine 12-Well-Platte übertragen und PBST-Lösung hinzufügen.</li>
		<li>Ersetzen Sie bei HAE-Kulturen die Antikörperlösung durch eine PBST-Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie die Lichtquellen und Filter, die für das konfokale Mikroskop verfügbar sind.</li>
	<li>Wählen Sie sekundäre Antikörper nach der Wirtsart. Wählen Sie die Fluorophorparameter (Erregungs- und Emissionswellenlängen, Spektrumbreite und Anregungseffizienz entsprechend der verfügbaren Lichtquelle). HINWEIS: Spektralparameter können mit Online-Tools modelliert werden (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörperlösungen vor, indem Sie sie mit einer BlockierenderLösung verdünnen.</li>
	<li>Mit sekundären Antikörpern inkubieren (wie in 6.3), aber 1 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben wie in Schritt 6.4.</li>
	<li>Nukleare Färbung und Gleitmontage<ol>
<li>Für Zellen auf Deckellips<ol>
<li>Aspirieren Sie den PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.</li>
			<li>Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
			<li>Legen Sie die Abdeckungen auf Tropfen von 10 L Montagemedium mit nach unten gerichteten Zellen.</li>
			<li>Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für HAE-Kulturen<ol>
<li>Aspirieren Sie den 1x PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.</li>
			<li>Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.</li>
			<li>Legen Sie die ausgeschnittenen Membranen auf Tropfen von 10 l Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches (5 l) Montagemedium hinzu.</li>
			<li>Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.</li>
			<li>Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Konfokale Mikroskopie
<ol><li>Definieren Sie die Spuren, indem Sie die verwendeten Fluorophore angeben.</li>
	<li>Wählen Sie den Scanmodus und die Geschwindigkeit aus.</li>
	<li>Passen Sie die Laserleistung, Verstärkung und Offset-Werte für jedes Fluorophor an, indem Sie sie mit den jeweiligen Negativkontrollen vergleichen: für Virus-, Mock-infizierte Zellen; für zelluläre Proteine, Proben, die mit Isotypkontrollantikörpern von einem geeigneten Wirt gefärbt sind.</li>
	<li>Um ein 3D-Bild zu erfassen, aktivieren Sie den Z-Stack-Modus, und legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte fest. Legen Sie die Schrittgröße/-zahl fest. HINWEIS: Weitere Informationen zur Coronavirus-Bildgebung finden Sie unter19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium.">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li><li>Banach, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression.">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li><li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+coronavirus+entry+into+cells.">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. ...

SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode, die markierte komplementäre DNA,RNA oder modifizierte Nukleinsäuresonden verwendet, die sich auf bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Zelle oder einem Gewebe lokalisieren.
Es wurde eine neue RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsmethode (RNA-FISH) entwickelt, die Modifikationen zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses über ein HCR1enthält. HCR ermöglicht die Untersuchung der RNA-Lokalisierung auf einzelliger Ebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Auflösung ist diese Methode nicht nur für wissenschaftliche Grundlagenstudien nützlich, sondern auch für Applikationsprojekte, z. B. Diagnostik. Kürzlich wurde die Machbarkeit dieser Methode für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA demonstriert, die lokalisiert ist, um Ciliated-Zellen in vollständig differenzierten 3D-Human-Atemwegsepithel-Kulturen (HAE)-Kulturen2. HAE-Kulturen stellen eines der fortschrittlichsten Werkzeuge zur Untersuchung von Virusinfektionen im Kontext der Mikroumgebung "natürliche Infektion"3,4dar.
Mehrere Berichte über humane Coronaviren (HCoV), einschließlich SARS-CoV-2, unterstreichen die Bedeutung epigenetischer Modifikationen in Bezug auf HCoV-Infektion und Pathophysiologie [überprüft in 5], z. B. das Methylierungsmuster des Gens, das das Angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE-2)-Rezeptor6,7kodiert. Interessanterweise identifizierte das massenspektrometrische Screening mehrere epigenetische Faktoren, die mit dem SARS-CoV-2-Proteom8interagieren. Genauer gesagt bindet das nichtstrukturelle Protein 5 (NSP5) an den epigenetischen Regulator, Histondeacetylase 2, und das katalytisch inaktive NSP5 (C145A) interagiert mit tRNA-Methyltransferase 1 (24). Zusätzlich wird die NSP16-Methyltransferase-Aktivität durch den Methyltransferase-Inhibitor Sinefungin9blockiert. Die genaue Rolle dieser epigenetischen Faktoren bei COVID-19 bleibt jedoch unklar. Die Replikation von HCoV erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle und löst Entzündungsreaktionen aus, die durch epigenetische Modifikationen reguliert werden10.
Zum Beispiel verfeinert HCoV-229E die Atomfaktor-Kappa B-Signalisierung und programmiert die hostzelluläre Chromatinlandschaft tiefgreifend um, indem die Acetylierung von H3K36 und H4K5 in bestimmten Regionen erhöht wird11. Die mit dem Middle East respiratorische Syndrom zusammenhängende Coronavirus-Infektion erhöht den Gehalt an H3K27me3 und erschöpft H3K4me3 in den Promotorregionen von Teilmengen spezifischer interferonempfindlicher Gene12. Zusätzlich löst virale RNA Immunreaktionen aus, wie bei den Flaviviren13, Retroviren14,15und Coronaviren16nachgewiesen. Die epigenetischen Marker auf viraler RNA können eine Rolle bei der Erkennung durch zelluläre Sensoren spielen, wie für die m7A-Methylierung des humanen Immundefizienzvirus-1-RNA17gezeigt. Es bleiben jedoch Fragen: Welche Auswirkungen hat SARS-CoV-2 RNA auf die Immunantwort, und sind epigenetische Markierungen beteiligt?
Hier wurde eine optimierte RNA-FISH-Methode in Verbindung mit der Immunfluoreszenzanalyse von Zelllinien und 3D-Geweben (voll differenzierte se) beschrieben. Obwohl zytologische Methoden wie FISH und Immunfluoreszenz weit verbreitet sind, wurde diese auf HCR basierende In-situ-Hybridisierungsmethode der neuen Generation nie für den Virennachweis verwendet (außer in einer kürzlich veröffentlichten Publikation)2. Im Allgemeinen erfordern Immunfärbung und FISH die folgenden Schritte: Permeabilisierung, um das Eindringen von Sonden oder Antikörpern zu ermöglichen; Fixierung, bei der zelluläres Material fixiert und konserviert wird; Nachweis, bei dem Antikörper oder Nukleinsäuresonden aufgetragen werden; und schließlich Montage der Proben zur Visualisierung.
Obwohl bestehende Protokolle diese allgemeinen Funktionen gemeinsam nutzen, unterscheiden sie sich in Bezug auf die beteiligten Parameter deutlich. Hier wurde ein optimiertes, einfaches Immun-RNA-FISH-Protokoll zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in HAE-Kulturen und Vero-Zellen beschrieben. Die Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Fixierung von Zellen mit Paraformaldehyd; (2) Permeabilisation mit Waschmittel oder Methanol (MeOH); (3) Rehydratation durch eine abgestufte Reihe von MeOH-Lösungen (nur HAE-Kulturen); (4) Erkennung; (5) Amplifikation mit HCR-Technologie zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA; (6) Immunfärbung; und (7) Bildgebung unter einem konfokalen Mikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td >ZEISS </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12965501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator Galaxy170R</td>
			<td >New Brunswick</td>
			<td>CO170R-230-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer Comfort</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td>5355 000 011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips</td>
			<td >LabSolute</td>
			<td >7695022</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL tubes</td>
			<td >FL-MEDICAL</td>
			<td >5.350.023.053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12-well plate</td>
			<td >TTP</td>
			<td >92412</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical centrifuge tube</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >5.332.547.254</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >serological pipets</td>
			<td >VWR Collection</td>
			<td >612-5523P, 612-5827P</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >slide glass</td>
			<td >PTH CHEMLAND</td>
			<td >04-296.202.03</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transwell ThinCerts</td>
			<td >Grainer bio-one</td>
			<td >665641</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#946;5-tubulin </td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td > sc-134234</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disodium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S51136-500G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >EGT101.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Amplification Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BAM01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S013922</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S012522</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Hybridization Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPH03821</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >PRE134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Wash Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPW01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >HEP001.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >63138-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >32213-1L-M</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopotassium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655-100G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6148-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PIPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >PIP666.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5405-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prolong Diamond Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >P36970</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >SOD001.5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trisodium Citrate 2-hydrate</td>
			<td >POCH</td>
			<td > 6132-04-3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >TWN580.500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Spectraviewer</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td>Modeling spectral parameters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ Fiji</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Acquiring and processing z-stack images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.

Das in diesem Manuskript beschriebene Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde mit zwei zellulären Systemen durchgeführt: einer Vero-Zelllinie und einer 3D-HAE-Kultur. Die wichtigsten Schritte für beide Zellmodelle sind in Tabelle 2dargestellt. Das RNA-FISH-Protokoll zur Visualisierung von SARS-CoV-2 in HAE-Kulturen umfasst Schritte, die typisch für Gewebeproben sind, d.h. Permeabilisation mit 100% MeOH und Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von MeOH-PBS- und 0,1% Tween-L...

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Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

visualization-sars-cov-2-using-immuno-rna-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.9K Aufrufe.  Jagiellonian University. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Serie: Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The increasing number of SARS-CoV-2 infections raises the need for better antibody detection assays. Current antibody detection methods compromise sensitivity for speed or are sensitive but time-consuming. A large proportion of SARS-CoV-2-neutralizing antibodies target the receptor-binding domain (RBD), one of the primary immunogenic compartments of SARS-CoV-2. We have recently designed and developed a highly sensitive, bioluminescent-tagged RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) to detect SARS-CoV-2 antibodies. The following text describes the procedure to produce the HiBiT-RBD complex and a fast assay to evaluate the presence of RBD-targeting antibodies using this tool. Due to the durability of the HiBiT-RBD protein product over a wide range of temperatures and the shorter experimental procedure that can be completed within 1 h, the protocol can be considered as a more efficient alternative to detect SARS-CoV-2 antibodies in patient serum samples.

The outlined protocol describes the procedure for producing the HiBiT-receptor-binding domain protein complex and its application for fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies.

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Quantifizierung von impfstoffinduzierten neutralisierenden Antikörpern in SARS-CoV-2-Varianten

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autor im Rampenlicht: Ein Pseudotyp-Virussystem zur Bewertung von Omikron-Subvarianten und zur Neutralisierung von Antikörpern in der SARS-CoV-2-Forschung

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Anwendung des Ha-CoV-2-Pseudovirus zur schnellen Quantifizierung von SARS-CoV-2-Varianten und neutralisierenden Antikörpern

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Methods Article

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung