Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode bietet, um vier zelluläre Kompartimente voneinander zu trennen, das Zytoplasma, den Zellkern, die Mitochondrien und die Membran. Nicht nur das, sondern es ist ein skalierbares, reproduzierbares Verfahren mit zuverlässigen Ergebnissen. Der große Vorteil dieser Technik ist die Trennung von vier Zellkompartimenten mit minimalem Einsatz von Reinigungsmitteln, was ein viel reproduzierbareres, zuverlässigeres Fraktionierungsverfahren ermöglicht.
Für die zytosolische Proteinisolierung züchten U937-Zellen in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zu einer Endsumme von sechs mal 10 zu den achten Zellen. Zentrifugieren Sie die Kultur und resuspendieren Sie das Zellpellet bei Raumtemperatur PBS auf eine Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter, wobei Sie vorsichtig pipettieren, um Klumpen aufzubrechen. Nach einer zweiten Zentrifugation wird das Pellet in eiskaltem Lysepuffer A in einer Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter resuspendiert.
Fügen Sie 7,5 Milliliter Zellen in ein konisches Röhrchen auf Eis für die nachgeschaltete Kernproteinextraktion hinzu und pelletieren Sie die verbleibenden Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet im zytoplasmatischen Isolationspuffer in einer Endkonzentration von zwei mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter und pipettieren Sie vorsichtig, um Klumpen aufzubrechen, bevor die Zellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit End-über-Ende-Rotation inkubiert werden. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und überführen den Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie den Überstand, um die Zelltrümmer zu sedimentieren. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und die Zentrifugationssequenz wiederholt, bis kein Pellet mehr beobachtet werden kann. Wenn die Probe frei von Ablagerungen ist, lagern Sie den zytosolfraktionshaltigen Überstand bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius.
Anschließend wird das eingelagerte Zellpellet im Lysepuffer A auf eine Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter resuspendiert. Für die Zellhomogenisierung zentrifugieren Sie die Zellsuspension und verwerfen den Überstand, um überschüssiges Digitonin und systolische Verunreinigungen zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Eiskaltzellen-Homogenisierungspuffer in einer Endkonzentration von vier mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter für eine 30-minütige Inkubation auf Eis.
In der Zwischenzeit fügen Sie für die mechanische Lyse auf Perlenbasis 30 Gramm vorgewaschene 3,2-Millimeter-Perlen aus Edelstahl zu 15 Milliliter Lysepuffer B in einem 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis hinzu, um zu kühlen. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie den Puffer im Röhrchen durch eine Zellsuspension und mischen die Zellen fünf Minuten lang mit Geschwindigkeit acht. Nach der Lyse wird das Homogenat in ein sauberes Röhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie das Homogenat und überführen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Um verbleibende Ablagerungen aus der Probe zu entfernen, zentrifugieren Sie das Homogenat dreimal wie angegeben und übertragen Sie den Überstand nach jeder Zentrifugation in ein neues Röhrchen. Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand zur Zentrifugation in ein neues Röhrchen überführt, um die rohe mitochondriale Fraktion zu isolieren.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und das rohe mitochondriale fraktionshaltige Pellet auf Eis gelegt. Um die Membranfraktion zu isolieren, zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand und legen Sie nach dem Verwerfen des Überstands das rohe Membranfraktions-enthaltende Pellet auf Eis. Für die isopyknische Dichtegradientenreinigung resuspendieren Sie die rohen mitochondrialen und Membranfraktionspellets in 200 Mikroliter Lysepuffer B und 1,8 Milliliter Jodixanol.
Um einen diskontinuierlichen Iodixanolgradienten für jede Probe zu erzeugen, fügen Sie zunächst einen Milliliter 15% Jodixanol zum Boden eines acht Milliliter offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens pro Probe hinzu. Als nächstes legen Sie nacheinander einen Milliliter 20% Iodixanol, einen Milliliter 25% Iodixanol, einen Milliliter 30% Iodixanol und einen Milliliter 35% Jodixanol unter die 15% Iodixanolschicht in jedem Röhrchen. Fügen Sie zwei Milliliter der rohen mitochondrialen Pelletsuspension unter der unteren Schicht eines Gradienten und zwei Milliliter der rohen Membranpelletsuspension unter der unteren Schicht des zweiten Gradienten hinzu.
Schichten Sie vorsichtig einen Milliliter 10% iodixanol auf die Oberseite jedes Gradienten und gleichen Sie die Röhrchen innerhalb von 10 Mikrogramm durch Zugabe von 10% Jodixanol nach Bedarf aus, bevor Sie die mitochondrialen und Membranfraktionen durch Dichtegradientenzentrifugation reinigen. Am Ende der Trennung verwenden Sie eine Nadel, um die Seite der dünnwandigen Röhrchen zu punktieren, um die sichtbaren Bänder von jeder Probe zu sammeln. Für die Kernproteinisolierung zentrifugieren Sie das 7,5-Milliliter-Aliquot von Zellen, die im Lysepuffer A suspendiert sind, und resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern eiskaltem Zell-Solubilisierungspuffer mit Pipettieren und Wirbeln.
Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang auf Eis, um das Plasma und die Organellenmembranen zu stören und gleichzeitig die Kernproteine zu schützen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspendieren das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren in 800 Mikrolitern eiskaltem Kernlysepuffer, ergänzt mit einer Einheit pro Mikroliter Benzonase. Inkubieren Sie die Mischung an einem End-über-Ende-Rotator bei vier Grad Celsius, um die Kernmembran zu stören.
Nach 30 Minuten die Mischung dreimal für fünf Sekunden bei 20% Leistung mit einer fünfsekündigen Pause zwischen den Impulsen beschallen, um die Nukleinsäuren zu scheren. Nach der letzten Beschallung zentrifugieren Sie das Homogenat und sammeln Sie den Überstand als Kernfraktion, ohne das Pellet zu stören. Western Blot jeder der Fraktionen nach der Reinigung des Dichtegradienten zeigt die Lokalisation der mitochondrialen Fraktion zu den 25- und 30%iodixanol-Schichten und die Lokalisation der Membranfraktion zu den 10- und 15%iodixanol-Schichten.
Die westliche Blutanalyse bestätigt auch, dass jede isolierte Probe rein und frei von Verunreinigungen durch Proteine aus anderen Teilen der Zelle ist. Darüber hinaus bestätigt die densitometrische Analyse der Bandenintensität jeder Probe die Reproduzierbarkeit und statistische Signifikanz der Daten. Eine unsachgemäße Durchführung der Fraktionierung kann zu einer Kreuzkontamination der zellulären Komponenten führen.
Eine hohe Konzentration von Histon H3 in der zytosolischen Fraktion kann beispielsweise auf eine unsachgemäße Klärung der zytosolischen Fraktion zurückzuführen sein. Ein Versagen während der isopyknischen Dichtereinigung kann zu einer Kontamination der Membranfraktion führen. Es kann nützlich sein, vor der westlichen Blutanalyse einen Proteinquantifizierungstest durchzuführen, um zu bestätigen, dass die Fraktionen tatsächlich Protein enthalten, um eine Gelbeladung basierend auf der Proteinmenge zu ermöglichen, und um zu bestätigen, dass das Verfahren ordnungsgemäß ausgeführt wurde.
Es ist wichtig, dass die zytoplasmatische Fraktion kein Pellet enthält. Western Blots oder ELISAs können nach diesem Verfahren durchgeführt werden, damit Sie die subzelluläre Position verschiedener Proteine unter bestimmten Bedingungen analysieren können. Diese Technik ermöglichte es uns, den Transport verschiedener Zelltodfaktoren unter Bedingungen der Hyperglykämie zu analysieren.
Und so half uns dies, den Mechanismus der hyperglykämischen Verschiebung von der Apoptose zur Nekrose zu beleuchten.
