Dieses Protokoll bietet eine Benchtop-Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit und der Wirkmechanismen der histotripsiegestützten thrombolytischen Therapie oder Lysotripsie, einem alternativen nicht-invasiven Ansatz zur Behandlung kritischer tiefer Venenthrombosen. Diese Technik verwendet Blasenaktivität, um eine zweiseitige Wirkung durch eine erhöhte Fibrinolyse aufgrund einer verbesserten lytischen Abgabe und der Hämolyse der roten Blutkörperchen im Gerinnsel zu erzielen. Dieser Tischansatz zur Behandlung von tiefen Venenthrombosen erleichtert die Modellierung von Blutgerinnseln, die Behandlung mit Lysotripsie und die gleichzeitige Bildgebung während der Behandlung.
Blasenwolkengenerierung, Behandlungsplanung und Bildführung können weiter verwendet werden, um In-vitro-Histotripsie-basierte Behandlungen anderer Krankheiten wie Nieren- und Lebertumoren zu untersuchen. Um die Histotripsiequelle einzurichten, montieren Sie die Quelle auf einem motorisierten Positioniersystem. Decken Sie das Imaging-Array mit einer Sondenabdeckung ab und fixieren Sie das Array koaxial in der Blende der Histotripsie-Quelle.
Schließen Sie das Bildgebungsarray an ein Ultraschall-Scanning-System an und tauchen Sie die Histotripsie-Quelle und das Imaging-Array vollständig in den Tank ein. Verwenden Sie eine Spritze, um Luftblasen vorsichtig zu entfernen, und verwenden Sie das Imaging-Array und den Scanner, um entgaste B-Modus-Wasserbilder mit 20 Bildern pro Sekunde zu erfassen. Passen Sie während der Aufnahme der Bilder die Position des Bildgebungsarrays innerhalb der öffnung des konfokalen Wandlers an, bis sich die Blasenwolke ungefähr in der Mitte des Bildfensters befindet, und zeichnen Sie die erkannte Fokusposition im Bildfenster auf.
Beenden Sie dann die Insonation und stellen Sie die an die Histotripsiequelle angelegte Spannung auf Null. Um ein Gerinnsel für die Analyse vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Zange das versiegelte Ende einer Pipette, die ein Gerinnsel enthält, und lassen Sie das Gerinnsel und das Serum in eine Petrischale gleiten. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gerinnsel auf eine Länge von einem Zentimeter zu schneiden, und verwenden Sie ein Reinigungstuch, um den geschnittenen Abschnitt vorsichtig zu tupfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um den Gerinnselabschnitt vorsichtig auf eine Waage zu legen und das Gewicht aufzuzeichnen. Als nächstes heben Sie den Strömungskanal manuell aus einem entgasten Umkehrosmose-Wassertank an und entfernen sie das Modellgefäß aus dem Kanal. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gerinnsel vorsichtig in das Modellgefäß zu legen, ohne das Gerinnsel zu beschädigen, und befestigen Sie das Gefäß am Strömungskanal.
Senken Sie den Strömungskanal in den Tank, so dass das proximale Ende der Stufe relativ zum Reservoir im Vergleich zur distalen Seite niedrig ist, und verwenden Sie eine Pipette, um dem Reservoir 30 Mikroliter 37 Grad Celsius erwärmtes Plasma hinzuzufügen. Überwachen Sie die Temperatur des Wassertanks, bis er mindestens 36 Grad Celsius erreicht, und fügen Sie mit einer Pipette 80,4 Mikrogramm rt-PA in das Plasmareservoir ein. Um den Strömungskanal anzusäsen, ziehen Sie mit einer Spritzenpumpe Plasma aus dem Reservoir in den Kanal, bis das Modellgefäß gefüllt ist.
Richten Sie dann das Modellgefäß manuell aus, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Modellgefäß vorhanden sind, wie im Bildfenster zu sehen. Um einen Pfad für die Histotripsiequelle und das Bildgebungsarray für eine gleichmäßige Histotripsiebelichtung entlang der Gerinnsellänge zu planen, verwenden Sie das Bildgebungsskript, um die motorisierten Positionierer zu verwenden, um das Bildgebungsarray parallel zur Länge des Gerinnsels auszurichten und zu bestätigen, dass keine Luftblasen im Gefäß vorhanden sind. Verwenden Sie die motorisierten Positionierer, um das Imaging-Array so auszurichten, dass die Imaging-Ebene parallel zum Querschnitt des Gerinnsels verläuft.
Bewegen Sie die Histotripsiequelle mithilfe des Bildgebungsfensters als Leitfaden zum proximalen Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir. Um den Resonanzpfad entlang der Gerinnsellänge zu bestimmen, legen Sie Wegpunkte entlang der Länge des Gerinnsels in Fünf-Millimeter-Schritten fest. Vor der Fertigstellung jedes Wegpunkts feuern Sie Testimpulse von der Histotripsiequelle mit den gleichen Insonationsparametern wie gezeigt, aber mit der Gesamtexposition auf 10 Gesamtimpulse reduziert.
Speichern Sie an jedem Wegpunkt die Motorpositionen mit den vom Hersteller angegebenen Befehlen. Um das Gerinnsel entlang seiner Länge entsprechend dem im Vorbehandlungsschritt definierten Pfad zu behandeln, stellen Sie die Spritzenpumpe auf 0,65 Milliliter pro Minute ein und warten Sie, bis sich der Meniskus des Plasmas bewegt hat. Interpolieren Sie den Behandlungspfad mit Zwischenschritten zwischen den festgelegten Wegpunkten mit einer festen Schrittgröße und verwenden Sie die Positionierer, um die Histotripsiequelle an jeder Pfadposition unter Verwendung der ursprünglich festgelegten Insonationsparameter zu verschieben.
Erstellen Sie als Nächstes ein Skript, um das Imaging-Array so einzustellen, dass es einige Sekunden vor der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Stelle ein B-Mode-Bild des Gerinnsels und des Modellgefäßes erfasst. Wenden Sie dann den Histotripsiepuls an jedem Wegpunkt an und erfassen Sie die akustischen Emissionen im Skript, um nach der Analyse passive Kavitationsbilder zu bilden. Verwenden Sie das Bildfenster, um die Blasenaktivität während der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Pfadposition abbilden.
Heben Sie nach der Analyse das Modellgefäß manuell aus dem Wassertank an, um das Perfusat über die Schwerkraft abzulassen, und ziehen Sie mit der Spritzenpumpe die Plasmalösung aus dem Strömungskanal, um das gesamte Perfusat in einem kleinen Becherglas zu sammeln. Trennen Sie das Modellgefäß, und entfernen Sie das Gerinnsel. Wischen Sie dann das Gerinnsel mit Laborgewebe ab und wiegen Sie das Gerinnsel, um den Verlust der Gerinnselmasse zu beurteilen.
Bei Anbringung einer ausreichenden Spannung an der Histotripsiequelle wird im Fokusbereich des Wandlers eine Blasenwolke erzeugt und mittels Ultraschallbildgebung visualisiert. Die Fokusposition ist definiert als das Zentrum der Blasenwolke. Dieses Kontrollperfusat eines Gerinnsels, das allein Plasma ausgesetzt war, und dieses Perfusat eines mit Lysotripsie behandelten Gerinnsels wurden verwendet, um den Hämoglobin- und D-Dimergehalt wie gezeigt zu beurteilen.
Die Variabilität der Hämoglobinkonzentration kann durch optische Absorption quantifiziert werden. Hier kann ein Gerinnsel innerhalb eines Modellgefäßes mittels B-Mode-Bildgebung vor der Histotripsie-Belichtung visualisiert werden, um die Gerinnselposition für die Segmentierung des passiven Kavitationsbildes zu bestimmen. Wie dieses passive Kavitationsbild, das mit dem B-Mode-Bild des Gerinnsels mitregistriert wurde, bestätigt, ist die akustische Energie während der Histotripsie-Belichtung hauptsächlich im Gerinnsel enthalten.
Bei Proben, die histotripsie ausgesetzt sind, ist die Störung in erster Linie auf das Gerinnselzentrum beschränkt, was mit den beobachteten Orten der Blasenaktivität übereinstimmt, die mittels passiver Kavitationsbildgebung verfolgt werden. Mit der Zugabe von Lytikum tritt der Massenverlust auch in Regionen auf, die näher an der Peripherie des Gerinnsels liegen. Alternativ können ökogene Liposomen, die rt-PA enthalten, anstelle der systemischen rt-PA-Verabreichung verwendet werden, um die Beurteilung der gezielten Wirkstoffabgabe an das Gerinnsel zu ermöglichen.
Lysotripsie bietet einen alternativen nicht-invasiven Ansatz zur Behandlung vieler Krankheiten. Dieses In-vitro-Protokoll ermöglicht die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung und ihres potenziellen Erfolgs in der In-vivo-Anwendung.
