Dieses Protokoll unterstützt die Charakterisierung der Rolle von Mückengenen, die an einer Vielzahl von physiologischen Signalwegen beteiligt sind, einschließlich beispielsweise Insektenresistenz und Malariaparasitenentwicklung. Die Methode treibt die Transgeninsertion in einzelne vorcharakterisierte genomische Stellen voran und ermöglicht daher den direkten Vergleich von Phänotypen, die aus alternativen Transgenen resultieren, wodurch das Problem des Positionseffekts effektiv vermieden wird. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Insektenarten von öffentlicher Gesundheit und landwirtschaftlicher Bedeutung angewendet werden, und ihre Anwendungen erstrecken sich weit von Bakterien bis hin zu Säugetierzellen.
Beginnen Sie mit der Entwicklung von attB-Donorplasmiden, die den dominanten Fluoreszenzmarker, attB-Rekombinationsstellen und die gewünschte Transgenfracht tragen. Verwenden Sie eine einzelne attB-Stelle für die Integration des gesamten Plasmids, das die transgene Kassette trägt, oder zwei invertierte attB-Stellen für den Kassettenaustausch. Reinigen Sie Spender- und Helferplasmide mit einem endotoxinfreien Reinigungskit.
Kombinieren Sie das attB-markierte Spenderplasmid, das das transgen von Interesse trägt, und das Helferplasmid, das die Integrase trägt, um eine Mischung mit einer Endkonzentration von 350 Nanogramm pro Mikroliter des Spenderplasmids und 150 Nanogramm pro Mikroliter des Helferplasmids zu erhalten. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 0,1 Volumen von drei molaren Natriumacetat und 2,5 Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzufügen, dann Wirbel. Ein weißer Niederschlag sollte sofort sichtbar sein.
Waschen Sie das Pellet und versenken Sie es in Injektionspuffer, um eine Gesamtendkonzentration von 500 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Bereiten Sie dann Aliquots von je 10-15 Mikrolitern vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Blut füttern vier bis sieben Tage alte Moskitos aus der gewünschten Dockingline und ihre Wildtyp-Gegenstücke 72 Stunden vor der Mikroinjektion.
Führen Sie Anopheles gambiae Embryo-Mikroinjektionen in 25 Millimolar-Natriumchlorid durch, indem Sie den hinteren Pol des Embryos in einem Winkel von 45 Grad anvisieren. Führen Sie Anopheles stephensi Embryo-Mikroinjektionen in Halocarbonöl durch, indem Sie den hinteren Pol in einem Winkel von 30 Grad anvisieren. Unmittelbar nach der Injektion die Eier in eine Petrischale geben, die mit sterilem destilliertem Wasser gefüllt ist, und sie in insektäre Bedingungen zurückbringen.
Nach dem Schlüpfen die G0-Larve täglich in ein Tablett mit gesalzenem destilliertem Wasser geben und zu den Puppen aufziehen. Sortieren Sie G0-Puppen nach Geschlecht unter einem Stereoskop. Lassen Sie die Männchen in getrennten Käfigen in Gruppen von drei bis fünf auftauchen und fügen Sie einen zehnfachen Überschuss an altersgerechten Wildtypweibchen hinzu.
Lassen Sie die Weibchen in getrennten Käfigen in Gruppen von 10 bis 15 auftauchen und fügen Sie eine gleiche Anzahl von altersgerechten Wildtypmännchen hinzu. Erlauben Sie Erwachsenen, sich für vier bis fünf Tage zu paaren und versorgen Sie die Weibchen mit einer Blutmahlzeit. Sammeln Sie die Eier und ziehen Sie aufstrebende G1s der nächsten Generation auf.
Sammeln Sie G1-, L3- und L4-Larven in einer Petrischale, die mit nassem Filterpapier ausgekleidet ist, oder auf einem Objektträger und screenen Sie sie mit einem fluoreszierenden Stereoskop auf das Vorhandensein des Markers, der mit der attB-markierten Ladung eingeführt wurde. Bei einzelnen ATTB-Designs, überprüfen Sie das Vorhandensein des neuen und bereits vorhandenen Markers. Für Doppel-ATTB-Designs für den Kassettenwechsel, Bildschirm für das Vorhandensein des neuen Markers und den Verlust des bereits vorhandenen.
Sortieren Sie transformierte G1-Puppen nach Geschlecht und kreuzen Sie sie massenhaft mit altersgerechten Wildtyp-Individuen des anderen Geschlechts. Lassen Sie Erwachsene sich vier bis fünf Tage paaren und geben Sie eine Blutmahlzeit. Sammeln Sie für einzelne Integrationsexperimente Eier direkt vom Massenkreuz.
Sammeln Sie für Kassettenaustauschexperimente Eier von einzelnen Weibchen und halten Sie die Nachkommen getrennt, bis die molekulare Bewertung aufgrund des möglichen Vorhandenseins von zwei alternativen Kassettenorientierungen abgeschlossen ist. Screenen Sie die G2-Nachkommen auf das Vorhandensein des fluoreszierenden Markers und legen Sie eine Untergruppe von G2-positiven Individuen für die molekulare Analyse beiseite. Ziehen Sie den Rest ins Erwachsenenalter zurück.
Führen Sie eine molekulare Validierung der Insertionsstellen mit PCR durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie für eine einzelne Integration sicher, dass die vorhergesagte Insertionsstelle das ursprüngliche Docking-Konstrukt sowie die gesamte Sequenz des Donorplasmids zwischen den beiden Hybridstellen attL und attR trägt. Stellen Sie beim Kassettenaustausch sicher, daß die vorhergesagte Einfügestelle mit der der Andocklinie identisch ist, wobei hybride invertierte ATTL-Stellen die ursprünglichen invertierten ATTP-Standorte ersetzen und die Austauschvorlage die ursprünglich zwischen ihnen vorhandene Kassette ersetzt.
Das Protokoll wurde verwendet, um in etwa 10 Wochen eine stabile transgene Anopheles-Linie zu erzeugen. Die phänotypische Validierung der Transformation wurde durch Screening auf fluoreszierende Marker durchgeführt, die durch den 3xP3-Promotor reguliert werden. Eine neue Anopheles stephensi-Linie wurde durch Einsetzen einer rot markierten DS-Kassette in eine mit CFP markierte Docking-Linie erhalten, was dazu führte, dass G1-Nachkommen beide Marker exprimierten, wie durch die rote und blaue Fluoreszenz in den Augen angezeigt.
Kassettenaustauschdesigns führen dazu, dass der ursprünglich in die Dockingline eingeführte Marker durch den des Donorplasmids ersetzt wird. Dieser Markeraustausch wurde in einer Anopheles gambiae-Andocklinie demonstriert, bei der der CFP-Marker verloren ging und der YFP-Marker erworben wurde, was zu einer Fluoreszenz des gelben Auges und der Nervenschnur führte. Gelegentlich kann RMCE zu einem einzigen Integrationsereignis anstelle des Austauschs der gewünschten transgenen Kassette führen, bei der eine Larve sowohl mit dem ursprünglichen CFP als auch mit den neuen YFP-Markern markiert ist.
Beim Screening auf das Vorhandensein eines Fluoreszenzmarkers ist es entscheidend, sein Signal von einer möglichen Hintergrund-Autofluoreszenz zu unterscheiden. Die Erhöhung der Vergrößerung und die Konzentration auf die Gewebe und Organe, bei denen die Fluoreszenz voraussichtlich vom Promotor angetrieben wird, ist notwendig, um echte CFP-positive Individuen zu identifizieren. Einzelne Transformanten wurden auch molekular mittels PCR untersucht, um die erwartete Insertionsstelle zu bestätigen.
Die PCR-Validierung bei Individuen aus einer Anopheles gambiae-Austauschlinie ist hier dargestellt. Selbst eine geeignete Mikroinjektionstechnik, das genaue Design und die Herstellung der Spender- und Helferplasmide sowie die Einhaltung des entsprechenden Mückenhaltungsschemas sind der Schlüssel zur Gewinnung transgener Individuen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Elemente einzufügen, die eine Überexpression oder Stummschaltung von Genen verursachen, beispielsweise das GAL4 / UAS-System sowie Gene-Drive-Elemente und Antipathogenmoleküle für die genetische Kontrolle von Mücken.
