iPS-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der Mikrogliabiologie in Gesundheit und Krankheit. Wir präsentieren ein einfaches Mikroglia-Differenzierungsprotokoll, das nur minimale Verwendung von Wachstumsfaktoren erfordert und eine hohe Reinheit und Ausbeute erreicht. Außerdem zeigen wir einen vollständig humanisierten Phagozytose-Assay.
iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen sind sehr empfindlich gegenüber Medienverdampfung. Sie sollten es vermeiden, die Vertiefungen in der Ecke der Zellkulturplatte zu verwenden, und alle leeren Brunnen mit Wasser füllen, um das Überleben zu verbessern. Sobald induzierte pluripotente Stammzellen oder iPSCs eine Konsistenz von 80% erreicht haben, dissoziieren Sie die Kolonien, indem Sie mit einem Milliliter DPBS waschen und einen Milliliter eines Dissoziationsreagenzes für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius hinzufügen.
Entfernen Sie die Kolonien mit einem Zelllifter, indem Sie mehrmals kratzen, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Suspension und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen mit neun Milliliter DPBS. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für eine Minute, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in einem Milliliter des embryoiden Körpers oder EB-Mediums.
Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellen und verdünnen Sie ein bis zwei mit Trypanblau. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie basierend auf der Zellzahl den Zellbestand auf eine endgültige Verdünnung von 10.000 Zellen pro 100 Mikroliter. Für die Beschichtung von Zellen fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Zellen pro Vertiefung in eine runde 96-Well-Platte mit geringer Haftung hinzu.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 125 mal g für drei Minuten und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier Tage. Ersetzen Sie am zweiten Tag mit einer Mehrkanalpipette das alte Halb-EB-Medium durch ein frisches Medium. Um primitive Makrophagen-Vorläufer oder PMPs zu erzeugen, beschichten Sie die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte durch Zugabe eines Milliliters eiskalter Matrigel-Beschichtungslösung.
Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden oder über Nacht. Am vierten Tag der EB-Differenzierung werden die EBs mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in die matrigelbeschichteten Vertiefungen überführt. Pipettieren Sie auf und ab, um die EBs aus dem Bohrloch zu entfernen.
Halten Sie dann die Platte geneigt, damit sich die EBs am Rand des Brunnens absetzen können. Sobald sich alle EBs beruhigt haben, pipetten und ersetzen Sie vorsichtig das alte Medium, während Sie das EB mit drei Milliliter frisch zubereitetem PMP-Komplettmedium am Rand des Bohrlochs halten. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen, indem Sie die Platte manuell von Seite zu Seite und von hinten nach vorne mischen.
Dann inkubieren Sie die Platte für sieben Tage, damit sich die EBs am Boden des Bohrlochs befestigen können. Nach sieben Tagen untersuchen Sie die EBs unter einem Lichtfeldmikroskop mit vierfacher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie am Boden der Vertiefungen befestigt sind. Führen Sie einen halben Mediumwechsel durch und ersetzen Sie an Tag 21 das komplette Medium durch drei Milliliter PMP-Medium.
Suchen Sie an Tag 28 nach runden Zellen, die als PMPs im Überstand bezeichnet werden. Sammeln Sie dann das Medium, das die PMPs enthält, mit einer 10-Milliliter-Pipette und einem automatischen Pipetter, ohne die EBs zu stören. Die PMPs im Medium in ein 15-Milliliter-konisches Rohr überführen.
Zentrifugieren Sie die gesammelten PMPs bei 200 mal g für vier Minuten und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie sie in ein bis zwei Milliliter mikrogliaähnlicher Zellen oder IMG-Basalmedium wieder suspendieren. Zählen Sie dann die Zellen auf dem Hämozytometer wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen und verdünnen Sie die PMPs auf die gewünschte Konzentration.
Anschließend werden die Zellen mit einer Dichte von 10 bis fünf Zellen pro Quadratzentimeter auf zellkulturbehandelten Platten mit frisch aufbereitetem IMG-Komplettmedium beschichtet. Für den Lebendzell-Phagozytose-Assay werden 20 bis 30 mal 10 bis vierte PMPs in eine 96-Well-Platte und 100 Mikroliter IMG-Komplettmedium gegeben und der Differenzierungsprozess für 10 Tage verfolgt. Am Tag des Assays 40 Mikroliter Medium pro Vertiefung entfernen und 10 Mikroliter der Kernfärbelösung hinzufügen.
Inkubieren Sie die Platte für zwei Stunden. Die markierten Synaptosomen auf Eis auftauen und eine Minute lang vorsichtig mit einem Wasserbeschaller beschallen. Legen Sie die Synaptosomen sofort auf Eis.
Verdünnen Sie die markierten Synaptosomen in IMG Complete Medium bei einem Mikroliter Synaptosomen pro 50 Mikroliter Medium. Zur Negativkontrolle werden 60 mikromolare Cytochalasin D in IMG-Komplettmedium hergestellt, um die Aktinpolymerisation und damit die Phagozytose zu hemmen. Dann fügen Sie 10 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Vertiefung für eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten.
Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und inkubieren Sie bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten. Halten Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 50 Mikroliter Medium hinzu, das Synaptosomen enthält. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 mal g für drei Minuten bei 10 Grad Celsius und halten Sie die Platte bis zur Bildaufnahme auf Eis.
Führen Sie die Platte in ein Live-Cell-Imaging-Lesegerät ein und wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus. Wählen Sie dann ein 20-faches Objektiv aus. Passen Sie als Nächstes den Fokus, die Leuchtdiode oder LED, die Intensität, die Integrationszeit und die Verstärkung der Hellfeld- und Blaukanäle an.
Die Synaptosomenfluoreszenz sollte zum Anfangszeitpunkt vernachlässigbar sein. Wählen Sie die Anzahl der einzelnen Kacheln aus, die in einer Montage pro Vertiefung erworben werden sollen. Erfassen Sie 16 Kacheln in der Mitte des Bohrlochs, die etwa 5 % der gesamten Bohrlochfläche abbilden.
Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und das gewünschte Zeitintervall für die Bildgebung ein. Öffnen Sie als Nächstes die Analysesoftware. Öffnen Sie dann das Experiment, das die Bilder enthält, und klicken Sie auf das Symbol Datenreduktion.
Wählen Sie im Menü unter Bildbearbeitung die Option Imaging Stitching aus, um ein vollständiges Bild aus den vier mal vier einzelnen Kacheln in der Montage mit den im Textmanuskript beschriebenen Parametern zu erstellen. Definieren Sie einen Intensitätsschwellenwert mithilfe der DAPI- und RFP-Kanäle für diese Bilder. Öffnen Sie ein Bild und klicken Sie auf Analysieren.
Wählen Sie unter Analyse die Option Mobilfunkanalyse aus, und wählen Sie unter Erkennungskanal ein zusammengefügtes Bild entweder im DAPI- oder RFP-Kanal aus. Wechseln Sie als Nächstes zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, und legen Sie einen Schwellenwert und Objektgrößenwerte fest, die die Zellkerne im DAPI-Kanal oder das Synaptosomensignal im RFP-Kanal richtig auswählen. Um die Anzahl der Kerne zu zählen, wechseln Sie zum Menü Datenreduktion, und wählen Sie unter Bildanalyse die Option Zellanalyse aus.
Wechseln Sie erneut zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, wählen Sie unter Kanal die DAPI-zusammengefügten Bilder aus, und verwenden Sie die im Textmanuskript beschriebenen Parameter. Wechseln Sie anschließend zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Zellenanzahl aus. Um dann den Bereich des Synaptosomensignals zu erhalten, wechseln Sie zum Menü Datenreduktion, und wählen Sie unter Analyse die Option Zelluläre Analyse aus.
Wechseln Sie erneut zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, wählen Sie unter Kanal die Option RFP-gestickte Bilder aus, und verwenden Sie die im Textmanuskript aufgeführten Parameter. Wechseln Sie anschließend zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Objektsummenbereich. Klicken Sie auf der Registerkarte Datenreduktion auf OK, damit die Software alle erfassten Bilder analysieren kann.
Sobald die Bilder analysiert wurden, exportieren Sie die Werte für Objektsummenbereich und Zellenanzahl für jeden Zeitpunkt. Teilen Sie dann die Objektsummenfläche durch die Zellanzahl, um die normalisierte Fläche pro Zeitpunkt zu berechnen. Wenn Sie mehrere Behandlungen oder Genotypen vergleichen, berechnen Sie den Phagozytoseindex mit der angegebenen Gleichung.
Undifferenzierte iPSCs zeigen eine kompakte Koloniemorphologie mit wohldefinierten Kanten. Dissoziierte iPSCs bildeten sphärische Aggregate, die als EBs bezeichnet werden, und wachsen bis zum vierten Tag der Differenzierung. Wenn die EBs für die PMP-Erzeugung plattiert werden, heften sie sich an die matrigelbeschichteten Platten, und eine Zellschicht breitet sich aus und umgibt die kugelförmigen Aggregate.
Am Tag 28 erscheinen runde Zellen mit einem großen Zytoplasma-Zellkern-Verhältnis in der Suspension. Es wird dringend empfohlen, iPSCs in Laminin 521-beschichteten Platten anstelle von Matrigel zu kultivieren, da die PMP-Ausbeute in Laminin 521-beschichteten Platten höher ist. Nach der Exposition von PMPs gegenüber dem IMG-Medium erwerben die Zellen eine mikrogliaähnliche Morphologie mit einem kleinen Zytoplasma in Gegenwart von länglichen Prozessen.
Darüber hinaus wurde die Mikroglia-Identität durch Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Typischerweise exprimieren mehr als 95% der Zellen IB1 und etwa 90% der Zellen exprimieren P2RY12 und TMEM119. Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass iPSC niedrigere Motoneuronen für humane Synaptosomen-exprimierte synaptische Marker, Synaptophysin und postsynaptisches Dichteprotein 95, ableitete.
Im Vergleich zum ursprünglichen Zeitpunkt war das rot fluoreszierende Signal nach 10 Stunden robust, da die meisten Synaptosomen verschluckt worden waren und in sauren intrazellulären Kompartimenten lokalisiert waren. In Cytochalasin D-behandelten IMGs zeigte eine starke Reduktion des roten Signals für null und 10 Stunden, dass das detektierte Signal aus phagozytischen Ereignissen resultiert. Die Fläche der verschlungenen Synaptosomen nahm mit der Zeit bis zu 16 Stunden zu.
Die Fläche des roten Signals von Cytochalasin D-behandelten Zellen nahm jedoch mit der Zeit nicht zu. iPS-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich Phagozytose und Entzündungsreaktion bei der Untersuchung von neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen.
