Makropinozytose ist ein endozytärer Weg, der für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich des Krebsstoffwechsels, wichtig ist. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, das Ausmaß der Makropinozytose in Zellen in vitro zu quantifizieren. Die Automatisierung zielt darauf ab, die Reproduzierbarkeit und Produktivität zu maximieren und die experimentelle Variation zu reduzieren.
Darüber hinaus können Sie mit der Fluoreszenzmikroskopie die Probe visuell untersuchen, um die experimentelle Qualität zu bestimmen und zusätzliche Makropinosomeneigenschaften zu bewerten. Mit mir wird Cheska Marie Galapate, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren. Für die 24-Well-Platte mit Deckglasformat verwenden Sie eine Pinzette, um einen einzelnen Deckglas aus dem Ethanolbad zu greifen.
Klopfen Sie mit dem Deckglas an die Innenwand der Platte, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, und legen Sie den Deckglas flach auf den Boden des Brunnens. Nachdem das Ethanol verdampft ist, waschen Sie den Deckglas zweimal mit DPBS und säen Sie dann die Zellen auf den Deckglas, indem Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Zellen in einen 37 Grad Celsius großen Zellinkubator mit 5% Kohlendioxid, bis die Zellkonfluenz am Tag vor der Makropinosomenmarkierung 60 bis 80% erreicht.
Ersetzen Sie am Tag vor der Makropinosomenmarkierung die Medien in den Vertiefungen durch 500 Mikroliter vorgewärmte serumfreie Medien und legen Sie die Zellen für 16 bis 24 Stunden in den Inkubator. Für das 96-Well-Mikrotiterplattenformat beginnen Sie mit der Übertragung der Zellsuspension in ein 25-Milliliter-Reagenzreservoir. Anschließend werden mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-High-Content-Screening-Mikrotiterplatte mit einem optisch klaren zyklischen Olefin- oder Glasboden gesät.
Inkubieren Sie die Zellen, bis die Zellkonfluenz am Tag vor der Makropinosomenmarkierung 60 bis 80% erreicht. Am Tag vor der Makropinosomen-Etikettierung entfernen und entsorgen Sie das Medium aus jedem Bohrloch mit einem Mehrkanal-Aspirationsadapter für Standardspitzen, die an einer Vakuumpumpe befestigt sind. Alternativ kann eine Mehrkanalpipette verwendet werden.
Geben Sie mit einem Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette vorsichtig 100 Mikroliter vorgewärmte serumfreie Medien in jede Vertiefung und legen Sie die Zellen dann für 16 bis 24 Stunden in den Zellinkubator. Für die 24-Well-Platte mit Deckglasformat ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen durch 200 Mikroliter serumfreie Medien durch fluorophormarkiertes hochmolekulares Dextran und legen Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellinkubator. Nach der Inkubation das Medium absaugen und die Zellen mit einer vorgekühlten Waschflasche vorsichtig, aber schnell fünfmal mit eiskaltem PBS waschen.
Schütteln Sie die Platte während des Waschens fest von Hand, um das Entfernen von Dextran-Aggregaten zu unterstützen, die an den Deckgläsern haften bleiben. Als nächstes fixieren Sie die Zellen, indem Sie 350 Mikroliter 3,7% Formaldehyd hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren, dann die Fixierungslösung absaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Färben Sie die Kerne mit 350 Mikrolitern DAPI in PBS.
Nach 20 Minuten die DAPI-Lösung absaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Kleben Sie Silikonisolatoren nebeneinander auf einen Objektträger, um einen gleichmäßigen Abstand und eine reproduzierbare Lokalisierung der für die Bildgebungsautomatisierung erforderlichen Deckgläser zu erhalten. Fügen Sie dann für jeden Deckglas einen Tropfen gehärtetes Fluoreszenz-Montagemedium auf dem Objektträger im offenen Raum des Isolators hinzu.
Heben Sie einen Deckglas mit einer Pinzette auf und entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Deckgläser auf ein fusselfreies Tuch klopfen. Legen Sie als Nächstes den Deckglaskopf auf den Tropfen des Montagemediums und klopfen Sie vorsichtig mit einer geschlossenen Pinzette auf den Deckglas, um Blasen vom Montagemedium zu entfernen. Lagern Sie die Dias in einer dunklen Umgebung und lassen Sie die Montagemedien bei Raumtemperatur trocknen, was typischerweise 16 bis 24 Stunden dauert.
Entfernen Sie vor der Bildgebung die Isolatoren vom Objektträger. Nachdem die Objektträger auf Raumtemperatur ausgeglichen wurden, reinigen Sie die Deckgläser mit einem mit ammoniakfreiem Glasreiniger benetzten Applikator mit Baumwollspitze. Verwenden Sie anschließend einen sauberen Applikator mit Baumwollspitze, der mit 70% Ethanol benetzt ist, um den Deckslip zu reinigen und trocken zu lassen.
Für das 96-Well-Mikroplattenformat werden nach dem Absaugen der Vertiefungen, wie zuvor demonstriert, 40 Mikroliter serumfreie Medien mit fluorophormarkiertem Dextran mit hohem Molekulargewicht in die Vertiefungen gegeben und dann die Zellen im Zellinkubator für 30 Minuten inkubiert. Entsorgen Sie nach der Inkubation das Medium in der Mikroplatte, indem Sie die Platte manuell auf den Kopf stellen in ein leeres Fünf-Liter-Becherglas drehen, dann spülen Sie die Zellen und die Mikroplatte zweimal ab, indem Sie die Platte langsam vertikal in einem leichten Winkel in ein mit eiskaltem PBS gefülltes Zwei-Liter-Becherglas tauchen und anschließend das PBS in der Mikrotiterplatte verwerfen, indem Sie die Platte kopfüber in das Fünf-Liter-Becherglas werfen. Nach der letzten PBS-Spülung fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 3,7% Formaldehyd in PBS in jede Vertiefung mit einem 25-Milliliter-Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette geben.
Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur entfernen Sie die Fixierlösung und waschen die Zellen mit PBS in der Tauch- und Flicktechnik. Färben Sie nach der zweiten PBS-Wäsche die Kerne mit 100 Mikrolitern DAPI in PBS pro Vertiefung. Nach 20 Minuten spülen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS aus, wie zuvor gezeigt.
Entfernen Sie alle PBS-Reste, indem Sie die Mikroplatte kopfüber auf ein fusselfreies Tuch klopfen. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisches PBS zu jeder Vertiefung mit einem 25-Milliliter-Reagenzreservoir und einer Mehrkanalpipette hinzu. Lassen Sie die Platte vor der Bildgebung auf Raumtemperatur ausgleichen und wischen Sie dann die Zellkulturplatte mit einem fusselfreien Tuch trocken.
Alternativ lagern Sie den Teller lichtgeschützt bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche. Erstellen Sie für die automatisierte Makropinosomen-Bildgebung ein Automatisierungsprotokoll, um die Bilder mit einem 40-fachen Luftobjektiv im Wellenlängenkanal des Dextranfluorophors und DAPI zu erfassen. Als nächstes optimieren Sie die Expositionseinstellungen mit einer Probe, von der vorhergesagt wird, dass sie den höchsten Grad an Makropinozytose aufweist, um eine Überbelichtung zu vermeiden, die zu einer Sättigung des Signals und einem Verlust der Intensitätsdaten führen kann.
Verwenden Sie Fokuseinstellungen, die das Sample schnell und konsistent lokalisieren, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen. Erfassen Sie mehrere Bilder in jedem Bohrloch oder Deckglas, um die Probenvariabilität zu berücksichtigen und eine genaue Darstellung der Probe zu erhalten. Um den makropinozytären Index zu bestimmen, subtrahieren Sie den Hintergrund für den DAPI und das entsprechende Dextranbild, indem Sie die entsprechende Funktion anwenden, die häufig als Rollkugelfunktion bezeichnet wird.
Passen Sie die Einstellungen so an, dass das Hintergrundrauschen mit minimalem bis keinem Subtraktionseffekt auf das DAPI- und Dextran-Signal minimiert wird. Bestimmen Sie als Nächstes mit einem Feld mit hohem Dextransignal die Intensitätssignaleinstellungen, die häufig als Schwellenwertfunktion bezeichnet werden, um die Kerne auszuwählen, und bestimmen Sie dann die minimale Intensitätssignaleinstellung, die erforderlich ist, um nur die Makropinosomen auszuwählen. Berechnen Sie für das Dextranbild die Gesamtfluoreszenz innerhalb der erzeugten Makropinosomenauswahl oder verwenden Sie die Auswahl, um die für Dextran positive Gesamtfläche zu bestimmen.
Verwenden Sie für das DAPI-Bild die Auswahl, um die Anzahl der Kerne im Bild zu bestimmen, um die Anzahl der vorhandenen Zellen widerzuspiegeln. Bestimmen Sie dann den makropinozytischen Index, indem Sie die gesamte Dextranfluoreszenz oder -fläche durch die Anzahl der durch DAPI bestimmten Zellen dividieren. In AsPC-1 PDAK-Zellen aktiviert die Zugabe von EGF bei 100 Nanogramm pro Milliliter für fünf Minuten vor der Zugabe des Dextrans die Makropinozytose.
Darüber hinaus kann die autokrine EGF-Aktivierung der Makropinozytose durch Glutaminentzug für 16 bis 24 Stunden induziert werden. MIA PaCa-2-Zellen zeigen eine konstitutive Makropinozytose, die durch eine 30-minütige Behandlung mit 75 mikromolarer EIPA oder eine zweistündige Behandlung mit 10 mikromolaren EHop-016 gehemmt wird. In einem Dosis-Wirkungs-Experiment nahm der makropinozytische Index bei höheren Wirkstoffkonzentrationen von EHop-016 und EIPA allmählich ab, wodurch die Existenz einer konstitutiven Rac1-abhängigen Makropinozytose bestätigt wurde.
Sie können dieses Verfahren anpassen, um die Makropinozytose anderer fluoreszierend markierter Fracht wie Albumin zu beurteilen. Darüber hinaus wird empfohlen, durch die Durchführung von Zelllebensfähigkeitstests zu bewerten, ob die makropinozytäre Aufnahme von Albumin zur Zellfitness beiträgt. Diese Technik war von zentraler Bedeutung für die Identifizierung der makropinozytären Nährstoffversorgung in Krebs- und Stromazellen, und die Automatisierung hat unsere Zustandstestkapazität erheblich erhöht.
