, NRSA (F32-NS-066698; DPS); Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Smith Family Foundation (BS), Dana-Stiftung (BS), John Merck Scholars Program (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801) unterstützt wird, Nancy Lurie Marks Foundation (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

1. Anterograde Markierung von RGC Präsynaptische Eingänge Hinweis: Alle Experimente, die die Verwendung von Tieren wurden in Übereinstimmung mit allen NIH-Richtlinien überprüft und durch die institutionelle Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss (IACUC) überwacht. <ol><li> Sterilisieren Feld und Instrumente. </li><li> Anesthetize Maus mit 4 Vol% Isofluran in einem Plexiglas-Induktionskammer (dies Vol% Isofluran arbeitet für Neugeborenen-erwachsenen Mäusen). Beachten Mäuse eng mit Über betäubende vermeiden. VORSICHT: Vermeiden Inhalation mit einer Vakuum Abgas Evakuierung. </li><li> Nach 1-3 min, (älteren Mäusen weniger Zeit benötigen) eine angemessene Höhe der Anästhesie wird durch Kneifen der Schwanz (keine Reaktion zu beachten) und unter Berücksichtigung der Atemfrequenz (Rate sollte langsam und stetig sein) erreicht. </li><li> Zeigen Maus unter dem Stereomikroskop auf die Seite und Ort Nasenkegel liefern 4.3 Vol% Isofluran über der Schnauze (Neugeborenen &lt;postnatalen Tag 10 (P10) ~ 4 Vol.%&gt; P10 ~ 3 Vol.%). </li><li> Setzen Sie die Lederhaut. Für die Injektion von Neugeborenen vor der Augenöffnung, verwenden Sie ein Paar kleine Feder Schere, um die Augenlider zu öffnen, und ziehen Sie die Haut, um die Lederhaut freizulegen. Bei älteren Mäusen, verwenden Sie die Finger, die Haut um die Augen, um die Lederhaut freizulegen zurückziehen. VORSICHT: Bei Neugeborenen, manchmal ein weiterer Schnitt senkrecht an der Ecke des Auges erforderlich ist. Vorsicht beim Schneiden der Ecke des Augenlids, da es ein Blutgefäß, das, wenn geschnitten wird, übermäßig bluten. </li><li> Verwenden Sie eine sterile 30,5 G Nadel ein kleines Loch in der Seite des Auges an der Linie, wo die Lederhaut beginnt zu punktieren. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Linse, die durch die Nadel gerade weit genug, dass die Kegel geht ins Auge. </li><li> Lassen Sie den Glaskörper, um aus dem Loch fließen, und eine sterile Wattestäbchen, um die Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Sobald die Glaskörper aus dem Loch mehr fließt, legen Sie eine stumpfe digen Nadel zu einer Hamilton-Spritze mit anterograde Tracing Farbstoff vorinstalliert befestigtin das Loch. ACHTUNG: Setzen Sie die Nadel langsam zu vermeiden Punktion der anderen Seite des Auges oder Beschädigung der Linse. </li><li> Langsam spritzen Farbstoff in das Auge. Typischerweise wird die Choleratoxin β-Untereinheit mit Alexa 594, 647 oder 488 (CTB-594, 647-CTB oder CTB-488, 5-6 ug / ul), konjugiert an anterograd Spur RGC Eingänge verwendet. Für Neugeborene (≤ P10) 1-2 ul ausreichend und für Mäuse&gt; P10 ~ 3 ul ist ausreichend. Hinweis: Alexa-Farbstoffe sind besonders beständig gegen lysosomale Abbau </li><li> Lassen Sie die Nadel in das Loch für ein paar Sekunden und dann langsam zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren und Farbstoff verhindern ein Auslaufen. </li><li> Eine kleine Menge der Antibiotika-Salbe für die Augen. Wenn Augen wurde operativ geöffnet, die Augenlider leicht zusammen neu zu positionieren. </li><li> Wenn die Injektion beide Augen, wiederholen Verfahren auf anderen Auge. </li><li> Nach der Injektion (en), lassen Maus unter einer Wärmelampe oder auf einem Heizkissen, bis sie beginnt, sich von der Anesth erholenESIA. </li><li> Zurück Maus auf eine saubere Heimkäfig und zu überwachen, um sicherzustellen, dass es ganz wach vor der Rückkehr in der Kolonie. </li></ol> 2. Bereiten Sie für Tissue Imaging Dieses Gewebe Vorbereitung Protokoll wird für Reporter Mäusen, in denen die Fresszellen mit fluoreszierenden Markern (zB CX3CR1-EGFP für Mikroglia) gekennzeichnet sind, verwendet. Wenn ein Reporter Leitung nicht verfügbar ist, kann der Forscher Gewebeschnitte Immunfärbung (siehe Diskussion). <ol><li> ~ 24 Stunden nach der Injektion, opfern die Maus und sezieren das Gehirn. </li><li> Lassen Sie beheben das Gehirn in ein Falcon-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C gefüllt ACHTUNG: PFA ist giftig. Einatmen und Hautkontakt durch Verwendung in einem Abzug oder einem Wartungstisch und das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung. Hinweise: Fixation kürzer (≥ 4 h) betragen. Zusätzlich kann anstelle von Tropfenfixierung, 4% PFA Perfusion kann von einem 2-24 Stunden Abgabe fix folgen. Allerdings Vergleich perfused feste Neugeborenen und Erwachsenen Gehirne fallen ergab keinen Unterschied in der Bildqualität oder Quantifizierung. </li><li> Spülen der Gehirn 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). <ol><li> Gießen Sie das Gehirn und PFA in ein leeres Boot wiegen. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn zu einem anderen zu übertragen wiegen Boot mit PBS gefüllt. </li><li> Wash Gehirn zweimal in PBS (Transfer Gehirn, zwei weitere Boote wiegen mit PBS gefüllt). </li></ol></li><li> Übertragen des Gehirns zu einem Falcon-Röhrchen mit einer 30% igen Saccharoselösung gefüllt. Das Gehirn verlassen Saccharose bei 4 ° C, bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Rohres (24-48 h). </li><li> Sobald das Gehirn sinkt, bereiten das Gehirn für das Schneiden. Die folgenden Schritte sind Herstellung von 40 um unter Verwendung eines schwimmenden Abschnitte Schlittenmikrotom mit einer Gefrierstufe (a Kryostaten kann auch verwendet werden). <ol><li> Verwenden einer Rasierklinge Teile des Gehirns, die nicht benötigt werden, zu entfernen (für den dCGL, entfernen Sie die rostralen und kaudalen Teile des Gehirns). </li><li> Frieren Sie den BHin auf Alufolie über Trockeneis. Während dieser Zeit einfrieren des Mikrotoms Bühne und füllen jedes Well einer 24-Well-Platte mit 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (PB). </li></ol></li><li> Montieren Sie den gefrorenen Gehirn (es sollte undurchsichtig erscheinen) über das Einfrieren der Bühne. <ol><li> Eine kleine Menge der optimalen Schneidtemperatur Verbindung (OCT) auf die Bühne. </li><li> Nachdem der Oktober beginnt zu frieren, lag das Gehirn im Oktober Das Ende des Gehirns, die geschnitten werden sollte nach oben (zB für die dCGL, das Gesicht der Schwanzseite nach oben). </li><li> Decken Sie das Gehirn und Oktober mit sehr fein gemahlen Trockeneis. </li><li> Lassen Trockeneis auf das Gehirn / Oktober für ~ 30 sek. </li><li> Verwenden Sie eine große Pinsel, um das Trockeneis entfernen. Das Gehirn und Oktober sollte auf der Bühne eingefroren werden. </li></ol></li><li> Beginnen Schneiden durch das Gewebe, bis der interessierende Bereich (ROI) erreicht wird. </li><li> Sobald der ROI erreicht ist, mit einem kleinen Pinsel auf Abschnitte von der Klinge zu entfernen und sie auf der 24-Loch-Plattforme 0,1 M PB (Schritt 2.5.2). Halten Sie den Pinsel feucht vor dem Entfernen von Abschnitten von der Klinge Netz es in der 0,1 M PB. Hinweis: Profile können in 0,1 M PB über Nacht bei 4 ° C belassen werden </li><li> Sobald Abschnitte gesammelt wurden, visualisieren die anterograde Kennzeichnung unter einem Fluoreszenz-Binokular und wählen Sie Abschnitte, die den ROI enthalten. </li><li> Montieren Abschnitte auf einer Folie mit einem kleinen Pinsel. <ol><li> Tragen Sie einen kleinen Pool von 0,1 M PB auf eine geladene Objektträger. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeschnitt in den Pool der PB. </li><li> Verwenden Sie die PB und Pinsel zu orientieren und die Ausbreitung der Gewebe. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe Docht überschüssige PB. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Feuchtigkeitsregulierung von der Sektion. </li><li> Lassen Sie die Luft vollständig trocken. </li><li> Eine kleine Tropfen Eindeckmedium zu jedem Abschnitt und montieren Ein Deckglas (22 x 50 mm, Nr. 1.5). </li><li> Siegel Kanten der Folie mit Nagellack und bei -20 ° C bis Bildgebungssitzung. Hinweis: Obwohl Bildgebung mitin einer Woche der Herstellung ratsam, können Folien bei -20 ° C für mehrere Wochen vor der Bilderzeugung erhalten werden. </li></ol></li></ol> 3. Tissue Imaging Alle Bilder werden auf einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop (Ultra Vox Kreiselscheibenapplikators Konfokalmikroskop mit Diodenlaser (405 nm, 445 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm und 640 nm) ausgestattet ist) erworben. Bilder können auch auf jedem Mikroskop mit der Fähigkeit, hohe Auflösung z-Stapel zu erwerben (z. B. konfokalen Laserrastermikroskop, Epifluoreszenz-Mikroskop, gefolgt durch Entfaltung, etc.) erworben werden. Rahmengröße ist in der Regel 1000 x 1000 Pixel. <ol><li> Finden ROI bei 10-facher Vergrößerung und erwerben Sie ein Bild. Zum Abbilden Mikroglia im retinogeniculate System ist der ROI Die mediale dCGL Abschnitte. </li><li> Verschiebung zu höheren Vergrößerung (60X ein Plan Apo Ziel, NA = 1.4, wird in der Regel verwendet wird). </li><li> Erwerben erstes Sichtfeld enthält Phagozyten unter Verwendung von 0,2 &amp;mgr; m z-Schritts. </li><li> Erwerben 15-19 mehr Felder mit Fresszellen pro Tier. </li></ol> 4. Bereiten Sie Bilder für Quantifizierung (ImageJ) <ol><li> Öffnen Z-Stapel in ImageJ. </li><li> Gehen Sie zu dem Bild-Menü, wählen Sie Farbe und Split Kanäle. </li><li> Subtrahieren Hintergrund aus dem Kanal (n) mit der Material verschlungen. <ol><li> Wählen Sie den Kanal-Fenster den verschlungen Material (z. B. präsynaptischen Eingänge). </li><li> Zum Prozess-Menü und wählen Subtrahieren Hintergrund. Verwenden Sie eine rollende Kugel Radius von 10 Pixeln für anterograde Tracing von präsynaptischen Eingänge im dCGL. Hinweis: Die rollende Kugel Radius wird empirisch ermittelt. Es sollte jedoch im allgemeinen so groß wie der Radius des größten Objektes in dem Bild, die nicht Teil des Hintergrundes. </li></ol></li><li> Glätten Sie den Kanal mit der Phagozyten. <ol><li> Wählen Sie den Kanal-Fenster den Phagozyten (zB Mikroglia). </li><li> Gehen Sie auf die Menü-und Prozess select Filter, Mittelwert. Verwenden Sie eine mittlere Filter von 1,5 (das Bild für die Oberflächen-Rendering in späteren Schritten glättet). </li></ol></li><li> Subtrahieren Hintergrund aus dem Kanal mit der Phagozyten. <ol><li> Wählen Sie den Kanal-Fenster den Phagozyten (zB Mikroglia). </li><li> Zum Prozess-Menü subtrahieren Hintergrund (Einstellungen müssen empirisch bestimmt). Verwenden Sie eine rollende Kugel Radius von 50 Pixeln für EGFP-positiven Mikroglia. </li></ol></li><li> Merge-Kanäle, indem Sie auf dem Bild-Menü und wählen Sie Farbe, Kanäle zusammenfügen. </li><li> Crop ROI enthält Phagozyten aus zusammengeführt Datei (das macht Oberflächen-Rendering schneller, siehe Schritt 5). <ol><li> Zeichnen Sie ein Rechteck um den ROI mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug in der Werkzeugleiste. </li><li> Gehen Sie zu dem Bild-Menü und wählen Sie Zuschneiden. </li></ol></li><li> Split Kanäle wieder (siehe Schritt 4.2). </li><li> Speichern Sie jeden Kanal als eigene TIFF-Datei. </li></ol> 5. Bereiten Bild für Quantifizierungin Imaris <ol><li> Offene Imaris und stellen Sie sicher, dass die Lautstärke-Symbol in der linken oberen Menü (Abbildung 2) ausgewählt. </li><li> Offene ersten Kanal zugeschnittene Bild (jeder der Kanäle geöffnet werden, nur konsequent sein). </li><li> In den anderen Kanal (n). Wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Kanäle hinzufügen, und wählen Sie den nächsten Kanal in der Datei. (Wiederholen Sie diesen Schritt für die restlichen Kanäle). Hinweis: Um die Farbe zu ändern, gehen Sie zur Anzeige Einstellung Fenster und klicken Sie auf den Kanalnamen (Abbildung 3A). Dadurch öffnet sich ein Dialogfeld, um die Farbe anzupassen. Wenn die Anzeige Einstellung nicht angezeigt wird, gehen Sie im Menü Bearbeiten und wählen Sie Anzeige Einstellung. </li><li> Passen Sie die Pixelwerte. Öffnen Sie das Menü Bearbeiten und wählen Sie Image-Eigenschaften. In diesem Fenster einstellen x, y, und z-Pixelwerte (Diese Werte hängen von dem Mikroskop, Ziel-, Kamera-, und z-Schritt-Akquisition und können in der verwendet wird, um das Bild zu erwerben, Software zu finden). </li><li> Schritt 5.5 wird in einer sehr Ergebniskleines Bild. Um zu ändern, klicken Sie auf das Fit-Symbol in der unteren rechten Ecke (Abbildung 2). </li><li> In der Anzeige Einstellung Fenster, die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal mit der linken und mittleren Dreiecke. </li></ol> 6. 3 Dimensional (3D) Oberflächendarstellung des Phagozyten <ol><li> In der oberen Werkzeugleiste sicher, dass die Surpass-Modus ausgewählt (Abbildung 3C). </li><li> In der Anzeige Einstellung Fenster, deaktivieren Sie alle Kanäle mit Ausnahme der Phagozyten-Kanal. Dadurch wird sie aus dem Sichtfeld zu entfernen. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol Oberflächen-Rendering (Abbildung 2). </li><li> Ein erstellen Fenster wird in der linken unteren (4A) angezeigt werden, stellen Sie sicher Segment ROI deaktiviert ist in diesem ersten Fenster. Klicken Sie auf die blaue Taste vorne an der Unterseite. </li><li> Stellen Sie die Glättung. <ol><li> Im nächsten Fenster wählen Sie die Phagozyten-Kanal aus dem Pull-Down-Menü (Abbildung 4B). Dieser passt dieMenge an Details, die taucht werden und sollte empirisch ermittelt werden (0,1 um Glättung wird in der Regel für Mikroglia verwendet wird). </li><li> Wählen Absolute Schwellen. </li><li> Klicken Sie auf den blauen Knopf vorne an der Unterseite. </li></ol></li><li> Threshold ist das Bild. <ol><li> Klicken Sie auf Histogramm und ziehen Sie, bis Bild wird entsprechend aufgetaucht (4C). Dies wird empirisch durch Drehen des Bildes um sicherzustellen, dass die auf dem Fluoreszenzbild überlagert grauen Flächen sind eine genaue Oberflächendarstellung bestimmt. Hinweise: Um zu drehen, wählen Navigieren Sie im Pointer-Menü auf der rechten oberen Seite des Bildschirms (3B), klicken und halten Bild zu drehen. Um das Bild zu ursprünglichen Ausrichtung zurückzukehren, wählen Origin unten im Menü Ansicht die Linke. </li><li> Klicken Sie auf den blauen Knopf vorne an der Unterseite. </li></ol></li><li> Im nächsten Fenster gibt es eine Option, um herauszufiltern, keine Flächen nach Größe, etc. Sofern nicht Bild ist sehr laut, nicht filtern und löschen einy-Filter, die automatisch angezeigt. Klicken Sie auf den grünen Pfeil an der Unterseite zum Rendern der Oberfläche beenden Phagozyten. Eine neue Gruppe von Tabs angezeigt (Fig. 5) </li><li> Falls erforderlich, löschen Sie alle Oberflächen, die nicht Teil des Phagozyten von Interesse sind. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Option Wählen Sie im Menü Pointer (3B) ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf die zu löschende Oberfläche, so dass es gelb wird. Um mehrere Flächen löschen, klicken Sie auf den Oberflächen, während Sie die Strg-Taste gedrückt halten. </li><li> Klicken Sie auf der Registerkarte Bleistift Löschen. </li></ol></li><li> Auswählen und Zusammenführen aller Oberflächen des Phagozyten in einer Oberfläche. <ol><li> Klicken Sie auf den Trichter (dh Registerkarte Filter, 5C). </li><li> Klicken Sie auf Hinzufügen. </li><li> Wählen Sie eine beliebige Filter, ziehen Sie das Histogramm zu weit links (alle Oberflächen zu gelb sein). </li><li> Gehen Sie auf der Registerkarte Bleistift und klicken Unify. </li></ol></li><li> Gehen Sie auf die Registerkarte Grafik (Abbildung 5A </sTrong&gt;), und klicken Sie auf Details, und wählen Sie alle Parameter angezeigt. Wählen Sie das Volume (5D). Für die Anzeige von mehreren Parametern, gehen Sie zum Schraubenschlüssel-Symbol unten links (Abbildung 2) und wählen Sie die Parameter für die Aufnahme. </li><li> Nehmen Sie die Lautstärke des Phagozyten und speichern Sie die Datei, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 7. 3D-Oberflächen-Rendering Engulfed Werkstoff <ol><li> Erstellen Sie einen neuen Kanal für Material, das durch die Phagozyten verschlungen wurde. <ol><li> Während die Phagozyten Oberfläche ausgewählt ist, klicken Sie auf der Registerkarte Bleistift. </li><li> Klicken Sie auf Alle Maske. </li><li> In dem Dialog, der erscheint, wählen Sie den Kanal entsprechend verschlungen Material (z. B. anterograde Tracing von präsynaptischen Eingänge; 5B). </li><li> Prüfen Sie vor der Anwendung doppelter Kanal-Maske und klicken Sie auf OK. </li><li> Ein neuer Kanal wird in der Anzeige Einstellung Fenster, die nur das Material, das versenkt wurde und enthält im Inneren die erscheinenPhagozyten. </li></ol></li><li> Oberfläche machen den Kanal mit insgesamt Engulfed und nonengulfed Material. <ol><li> Deaktivieren Sie alle Kanäle in der Anzeige Einstellung Fenster außer dem Kanal aufgetaucht werden, und deaktivieren Sie die Oberfläche für die Phagozyten erstellt. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol Oberflächen-Rendering wieder (siehe Schritt 6.3) und eine Fläche für den Kanal mit den gleichen Schritten wie für die Phagozyten beschrieben (Schritte von 6,4 bis 6,11). Hinweise: Achten Sie darauf, den richtigen Kanal vor dem Glätten und Schwellen (Schritt 6,5; 4B) zu wählen. Notieren Sie sich den Schwellenwert (siehe Schritt 6.6; 4C). Dieser Wert kann auch nach der Oberflächenwiedergabe erzielt werden abgeschlossen (Zauberstab Registerkarte, 5A). </li></ol></li><li> Nehmen Sie die Lautstärke des Gesamt verschlungen und nicht-Material verschlungen und speichern Sie die Datei, bevor Sie fortfahren. </li><li> Oberflächen machen verschlungen Material (Material innerhalb der Phagozyten). <ol><li> Visualisieren Fluoreszenz nurder neue Kanal von Material verschlungen (siehe Schritt 7.2.1). </li><li> Führen Sie die gleichen Schritte wie oben (Schritte von 7,2 bis 7,3). Hinweise: Achten Sie darauf, den richtigen Kanal aus dem Pull-Down-Menü vor dem Glätten wählen (wählen Sie den neuen Kanal in Schritt 7.1 erstellt). In den Schwellenfenster, geben Sie manuell den Schwellenwert, der für die Darstellung des Gesamt verschlungen und nicht verschlungen Material (siehe Schritt 7.2.2) festgelegt wurde. </li></ol></li><li> Nehmen Sie die Lautstärke des Material verschlungen und Datei speichern, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 8. Berechnen Sie die Gesamtlautstärke des Field of View <ol><li> Erstellen Sie eine neue Oberfläche für jeden Kanal. </li><li> In den Schwellen Fenster (Schritt 6.6), schieben Sie das Histogramm den ganzen Weg auf der linken Seite, so dass das gesamte Feld aufgetaucht. </li><li> Beenden Auftauchen das gesamte Feld und notieren Sie die Lautstärke (Schritte von 6,7 bis 6,11). </li><li> Speichern Sie die Datei. </li></ol> 9. Berechnen Sie die Anzahl der phagozytierten Werkstoff <ol><li> Berechnen der Dichte desGesamt verschlungen und nicht verschlungen Material-Kanal mit dem folgenden Algorithmus: Volumen des Gesamt Engulfed und Non-Engulfed Werkstoff (Schritt 7.3) / Volume of Field (Schritt 8). </li><li> Berechnen% Einwirkung pro Zelle mit dem folgenden Algorithmus: (Volumen der Engulfed Werkstoff (Schritt 7,5) / Gesamtvolumen der Phagozyten (Schritt 6.11)) x 100 Anmerkung: Um die Variationen in der Zellgröße zu berücksichtigen, werden Daten auf das Gesamtvolumen des Phagozyten normalisiert. Wenn Zahlen von Schritt 9.1 sind sehr variabel in Bereichen kann es erforderlich sein, die Daten aus Schritt 9.2 bis 9.1 in der Berechnung zu normalisieren. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+loss+and+synaptic+alterations+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease.</a> Mol Neurobiol. 37 (1), 73-82 (2008).</li><li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 9 (3 Suppl), 91-99 (2006).</li><li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model.">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (1016).</li><li>Milnerwood, A. J., Raymond, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+synaptic+pathophysiology+in+neurodegeneration:+insights+from+Huntington's+disease.">Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease.</a> Trends Neurosci. 33 (11), 513-523 (2010).</li><li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sweepers+in+the+CNS:+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis.">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li><li>Rotshenker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+macrophage+activation+and+the+regulation+of+complement-receptor-3+(CR3/MAC-1)-mediated+myelin+phagocytosis+in+injury+and+disease.">Microglia and macrophage activation and the regulation of complement-receptor-3 (CR3/MAC-1)-mediated myelin phagocytosis in injury and disease.</a> J Mol Neurosci. 21 (1), 65-72 (2003).</li><li>Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+myelin+in+demyelinative+disease:+a+review.">Phagocytosis of myelin in demyelinative disease: a review.</a> Neurochem Res. 24 (2), 261-268 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um genau zu messen, Phagozytose, müssen verschlungen Material in einer Weise, dass der Forscher kann es einmal zu visualisieren lysosomalen Abbau aufgetreten gekennzeichnet werden. Außerdem wird eine hochauflösende Abbildung benötigt wird, gefolgt von der Verwendung von Software, die dem Forscher ermöglichen, das Volumen der gesamten Zell visualisieren und zu quantifizieren, dessen Inhalt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine sehr zuverlässige und quantitative Verfahren zur Messung von Phagozyten-vermittelte E...

<html> Synaptischen Schaltungen umzu während der gesamten Lebensdauer des Tieres. In der sich entwickelnden Gehirn, Synapsen im Überschuss und muss synaptischen Beschneidung, die die selektive Entfernung einer Teilmenge von Synapsen und die Erhaltung und Stärkung dieser Synapsen, die 8-10 bleiben beinhaltet zu unterziehen. Dieser Vorgang ist notwendig, um die genaue Verbindungscharakteristik des adulten Nervensystems zu erreichen. Beim Erwachsenen kann Synapsen auch Kunststoff sein, insbesondere im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnis. Die strukturellen Korrelate dieser Plastizität sind gedacht, um das Hinzufügen und / oder Beseitigung von dendritischen Dornen und präsynaptischen Boutons 11-13 enthalten. Zusätzlich zu diesen Rollen in der gesunden Nervensystems, wird synaptischen Umbau auch im Nervensystem Krankheit / Verletzung 12,14,15 beteiligt. Zum Beispiel, nach Rückenmarksverletzungen, abgetrennten Axone müssen anschließend umzugestalten und bilden neue Synapsen, um die funktionelle Erholung von 16 bis 19 zu erreichen. nt &quot;&gt; Schwellen als ein wichtiger Aspekt der synaptischen Plastizität ist der Prozess der Phagozytose oder Einwirkung von Synapsen für die Entfernung 3,5,20 bestimmt. Wir haben kürzlich gezeigt, dieses Phänomen im Rahmen der synaptischen Rebschnitt in der gesunden, postnatalen Gehirn der Maus 7. ​​Insbesondere Mikroglia, die ansässige ZNS Immunzellen und Fresszellen, wurde gezeigt, präsynaptischen Eingänge während einer Spitzenzeit und in einem Bereich von Entwicklungs synaptischen Rebschnitt, der postnatalen dorsalen seitlichen Kniehöcker (dCGL) des Thalamus zu verschlingen. genetische oder pharmakologische Blockade dieser Einwirkung führte zu anhaltenden Defizite in der synaptischen Verbindungen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine zuverlässige und hoch quantitative Assay Phagozyten-vermittelte Phagozytose von präsynaptischen Eingänge messen. Für die Zwecke dieses Artikels wird dieser Test im Rahmen der Entwicklungs retinogeniculate System, das Netzhautganglienzellen beinhalten (RGCs), die sich in der Netzhaut angebracht werden, dassprojizieren präsynaptische Eingänge des dCGL (Fig. 1A). Um zu beginnen, wird ein lysosomalen Degradation beständigen anterograde Markierungsstrategie beschrieben, die verwendet wird, um RGC-spezifischen präsynaptischen Eingänge im dCGL (Fig. 1) 7,21 visualisieren. Nach dieser Beschreibung wird eine detaillierte Methode zur Bildgebung und quantitativen Messung Einwirkung mittels konfokaler Mikroskopie in Kombination mit der 3-dimensionalen (3D) Volumen-Rendering Oberfläche gegeben werden. Diese Methodik basiert auf fixierten Gewebepräparation kann aber auch zur Verwendung bei Echtzeit-Bildgebung Studien angepasst werden. Wichtig ist, während der Test wurde im Rahmen des gesunden, postnatale retinogeniculate Systems validiert worden sind, könnte man die gleichen Verfahren anzuwenden, um andere Phagozyten-Neuron-Interaktionen im Gehirn und während Krankheit sowie Phagozytenfunktion in anderen Organsystemen zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="533">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Vet Equip, Inc.</td>
			<td style="width:168px;">965500&#160;</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:144px;">Warm water source for heat pad</td>
			<td style="width:159px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:168px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:144px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:159px;">DSC Optical</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:144px;">Sliding microtome with freezing stage</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">Leica</td>
			<td rowspan="2" style="width:168px;">SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:144px;">Microtome blade</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:168px;">14021607100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Fluorescent dissecting microscope</td>
			<td style="width:159px;">Nikon</td>
			<td style="width:168px;">SMZ800 with Epi-fluorescence attachment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:144px;">Spinning disk confocal microscope</td>
			<td style="width:159px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:168px;">UltraView Vox Spinning Disk Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">10 &#181;l Hamilton gas tight syringes</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">80030</td>
			<td style="width:144px;">Use a different syringe for each color dye/tracer</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hamilton needles</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:116px;">7803-05, specifications: blunt, 1.5&#34;</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="54" rowspan="3" style="height:54px;width:131px;">Alexa-conjugated cholera toxin &#946; subunit (CTB)</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:116px;">488: C22841</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;">Reconstitute in sterile saline, 80 &#181;l (488), 100 &#181;l (594), 20 &#181;l (647)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">594: C22842</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:116px;">647: C34778</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Phosphate Buffered Saline&#160;(PBS)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:131px;">Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment USP (antibiotic ointment)</td>
			<td style="width:131px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:116px;">24208-780-55</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">30.5 gauge needle</td>
			<td style="width:131px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:116px;">305106</td>
			<td rowspan="3" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5630</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Cotton-tipped applicator</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:116px;">23-400-125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="104" rowspan="2" style="height:104px;width:131px;">Paraformaldeyde (PFA)</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:116px;">15710</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Dilute 16%to 4% in PBS. Paraformaldehye is toxic, use&#160; in a fume hood and wear personal protective equipment.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="138" rowspan="4" style="height:138px;width:131px;">Dissection tools &#8211; scissors, forceps, spatula</td>
			<td style="width:131px;">Small scissors: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">Small scissors:14370-22</td>
			<td rowspan="4" style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Large scissors: Roboz</td>
			<td style="width:116px;">Large scissors: RS-6820</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">#55 forceps: Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">#55 forceps: 11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Spatula: Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:116px;">Spatula: 13504</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:131px;">Sucrose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S8501-5KG</td>
			<td style="width:144px;">Make 30% sucrose in PBS (weight/vol)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">25608-930</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Weigh boat</td>
			<td style="width:131px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:116px;">2347-1426</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">24-well plates</td>
			<td style="width:131px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:116px;">353047</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">S6566-500G</td>
			<td rowspan="2" style="width:144px;">Make 0.2 M sodium phosphate monobasic (PB-A) in ddH20 and 0.2 M sodium phosphate dibasic (PB-B) in ddH20.&#160; To make 0.1 M PB, combine 19 ml PB-A and 81 ml PB-B, fill to 200 ml with ddH20&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:131px;">Sodium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td>S5136-500G</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Coverslips, 22 X 50 mm, No. 1.5</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48393 194</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:131px;">Charged microscope slide</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:116px;">48311-703</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:131px;">Vectasheild</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:116px;">H-1200</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engulfment assay: a protocol to assess interactions between cns phagocytes and neurons

Phagozytose ist ein Prozess, in dem eine Zelle verschlingt Material (gesamte Zelle, Zellteile, Schutt, etc.) in der extrazellulären Umgebung umgibt und dieses Material anschließend verdaut, allgemein durch lysosomalen Abbau. Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), deren phagozytierenden Funktion in einem breiten Bereich von Bedingungen, die an neurodegenerativen Erkrankungen (z. B. beta-Amyloid-Clearance bei Alzheimer-Krankheit), um die Entwicklung von gesunden Gehirn (zB synaptischen beschrieben Beschneiden) 1-6. Das folgende Protokoll ist ein Einwirkung Assay entwickelt, zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs Maus retinogeniculate System 7. Während dieser Assay wurde verwendet, um Mikroglia-Funktion in diesem Zusammenhang zu bewerten, kann ein ähnlicher Ansatz verwendet werden, um andere Phagozyten im Gehirn (beispielsweise Astrozyten) und dem Rest des Körpers zu beurteilen(Z. B. peripheren Makrophagen) sowie andere Kontexte, in denen die synaptische Umbau auftritt (z. B. Hirnverletzung / Krankheit).

Kürzlich haben wir diesen Test Einwirkung zu visualisieren und zu quantifizieren Mikroglia-vermittelten Phagozytose von präsynaptischen Eingänge in den Entwicklungs retinogeniculate System (Abbildung 1) 7. RGCs von CX3CR1-EGFP heterozygote Mäuse wurden anterograd mit CTB-594 und CTB-647 zurückgeführt in die linke und rechte Auge. Nach dieser Verfolgung wurden EGFP-positiven Mikroglia im dCGL abgebildet. Diese Bilder wurden anschließend zur Volumenmessung Oberfläche gerendert. <p c...

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An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

an-engulfment-assay-protocol-to-assess-interactions-between-cns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.1K Aufrufe.  Boston Children's Hospital, Harvard Medical School.  Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben. 

Serie: An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Ein präklinisches Modell zur Beurteilung der Gehirnerholung nach akutem Schlaganfall bei Ratten

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...