Nuestro protocolo proporciona información visual y en tiempo real sobre cómo se produce el proceso de morfogénesis ocular en condiciones normales y patológicas. Nuestro protocolo permite la adquisición rápida de pilas z, lo que disminuye la cantidad de tiempo entre cada imagen 3D en el conjunto de datos. Esto proporciona una mayor resolución temporal de cómo se produce la morfogénesis ocular.
Posicionar el embrión dentro del capilar puede ser un desafío debido a su forma esférica en la etapa de somita única, por lo que es importante cargar múltiples embriones en el capilar para asegurarse de que al menos uno esté en la orientación correcta. Para detectar la presencia de somitas a las 10 horas después de la fertilización, coloque los embriones bajo un microscopio estereoscópico y use un adaptador de fluorescencia para confirmar la presencia del transgén rx3: GFP. Una vez que se hayan identificado de tres a cinco embriones de somita únicos GFP positivos, use fórceps finos para decorionar los embriones.
Para incrustar los embriones en agarosa, transfiera los embriones a un tubo de microcentrífuga que contiene 500 microlitros de tampón embrionario E3 complementado con 168 microgramos por mililitro de tricaína y agregue 500 microlitros de agarosa refrigerada pero líquida a baja temperatura de fusión y tampón E3 al tubo con una mezcla suave. Use un capilar de vidrio de un milímetro con un émbolo de PTFE para tirar de los embriones incrustados en agarosa en el capilar y deje que la agarosa se solidifique durante 30 a 60 segundos a temperatura ambiente. Luego coloque el capilar en un vaso de precipitados de tampón E3 suplementado con tricaína.
Para configurar un microscopio de hoja de luz para imágenes de embriones, coloque el capilar en el soporte de muestra capilar y haga clic en la vaina de metal en el centro del disco metálico del soporte. Coloque dos tapones de goma en la vaina con las ranuras mirando hacia los extremos de la vaina y deslice el capilar a través del centro de los tapones de goma. Una vez que el marcador esté en la base de la funda de metal, use la tapa de metal para asegurar el capilar en su lugar y coloque el soporte en la parte superior del microscopio con las marcas blancas alineadas.
Cierre la tapa del portamuestras y haga clic en el botón localizar capilar en la interfaz del software del microscopio. Usando el panel de control Ergo Drive, mueva el capilar justo por encima del objetivo. Después de abrir la tapa, empuje suavemente el émbolo hasta que la sección de agarosa que contiene el embrión cuelgue debajo de la parte inferior capilar frente al objetivo.
Desactive localizar capilar y haga clic en Localizar muestra para cambiar la vista de la cámara web de la cámara de muestra al objetivo del microscopio y utilice esta vista para ajustar la posición de la muestra con mayor precisión. A continuación, desactive la muestra de localización y cambie a la pestaña de adquisición. Marque las casillas z-stack y series temporales.
En la ventana de parámetros del modo de adquisición, seleccione la configuración de hoja de luz de doble lado y marque las casillas para la fusión de doble lado en línea y el escaneo dinámico. Haga clic en continuo para obtener una vista en vivo del embrión. En la ventana del canal, seleccione el canal 488 y ajuste la potencia del láser a uno y el tiempo de exposición a 7,5 milisegundos.
Utilice el panel de control Ergo Drive para ajustar la posición del embrión hasta que el campo ocular esté directamente orientado hacia la cámara y ajuste las hojas de luz izquierda y derecha en los parámetros de los canales hasta que el campo ocular esté lo suficientemente enfocado. Establezca la primera y la última posición z alrededor de 500 micrómetros más allá de la última señal fluorescente detectable y haga clic en óptimo para establecer el tamaño del paso en 0,477 micrómetros. Para establecer los parámetros de incubación, marque la casilla de la unidad Peltier para mantener la temperatura en 28 grados centígrados.
En la ventana de series temporales, seleccione la frecuencia experimental y el intervalo de tiempo adecuados para adquirir las imágenes. Haga clic en Iniciar experimento. Seleccione la carpeta para guardar el conjunto de imágenes y establezca el prefijo de imagen, luego haga clic en guardar para iniciar la imagen.
Para el análisis de imágenes, importe los archivos de imagen en un programa de software de análisis de imágenes 4D adecuado y haga clic en el cubo del visor 4D, la barra de escala y el icono de vídeo para abrir la barra de tareas del guión gráfico. Seleccione agregar secuencia de fotogramas clave y especifique la duración del video en segundos. Desmarca la casilla Crear rotación y marca usar la progresión de tiempo para incluir puntos de tiempo específicos en el vídeo.
Guarde el guión gráfico para aplicar los mismos parámetros a varios conjuntos de imágenes. Haga clic en exportar película para guardar un vídeo de la imagen de lapso de tiempo y especifique la configuración de exportación de la película, incluido el nombre y la ubicación del archivo, el formato de vídeo, la resolución de vídeo, la velocidad de fotogramas y la resolución de datos. Agregue marcas de tiempo si lo desea y seleccione grabar.
Para crear videos de rotación en puntos de tiempo específicos, agregue una secuencia de fotogramas clave como se acaba de demostrar, pero marque la casilla crear rotación y desmarque la casilla usar progresión de tiempo. Para representar una imagen de alta resolución en cualquier orientación y en cualquier punto de tiempo individual, seleccione el icono de la cámara en el visor 4D. Para crear una canalización para el análisis, seleccione matraz para acceder al panel de análisis y abra el menú operaciones de análisis para seleccionar la secuencia de operaciones de interés.
Haga clic en el triángulo azul para iniciar la canalización. Al final de la ejecución, haga clic en columnas de entidades en la ventana emergente para ver una lista de las características que pueden proporcionar información sobre el objeto de interés y, a continuación, haga clic en exportar para exportar los datos a una hoja de cálculo. En este análisis representativo, se tomó una imagen de un embrión transgénico rx3:GFP desde el punto de vista dorsal cada cinco minutos desde la etapa de somita hasta las 24 horas posteriores a la fertilización durante un total de 14 horas.
Como se observó, la realización de una ejecución de tubería de las imágenes capturadas de este análisis facilitó la generación de una máscara del ojo en desarrollo. Tenga en cuenta que cuando el campo ocular se separa en dos vesículas ópticas, se pudo observar una tercera región positiva rx3: GFP en el cerebro anterior que contribuyó al hipotálamo. Esta información también se observó en los datos de volumen y se puede separar fácilmente de los datos de la vesícula óptica, ya que era mucho más pequeña en volumen que la observada para cualquiera de las vesículas ópticas.
Este procedimiento se puede seguir con análisis adicionales, por ejemplo, el seguimiento de celdas individuales en todo el conjunto de datos de imágenes.
