Наш протокол предоставляет как визуальную, так и в режиме реального времени информацию о том, как происходит процесс глазного морфогенеза как в нормальных, так и в патологических условиях. Наш протокол позволяет быстро получать z-стеки, что уменьшает количество времени между каждым 3D-изображением в наборе данных. Это обеспечивает повышенное временное разрешение того, как происходит глазной морфогенез.
Позиционирование эмбриона в капилляре может быть сложным из-за его сферической формы на стадии одиночного сомита, поэтому важно загрузить несколько эмбрионов в капилляр, чтобы убедиться, что по крайней мере один из них находится в правильной ориентации. Чтобы проверить наличие сомитов через 10 часов после оплодотворения, поместите эмбрионы под стереомикроскоп и используйте флуоресцентный адаптер для подтверждения наличия трансгена rx3: GFP. После того, как три-пять GFP-положительных эмбрионов с одним сомитом были идентифицированы, используйте тонкие щипцы для декорирования эмбрионов.
Чтобы встроить эмбрионы в агарозу, перенесите эмбрионы в микроцентрифужную трубку, содержащую 500 микролитров буфера эмбриона Е3, дополненного 168 микрограммами на миллилитр трицина, и добавьте в трубку 500 микролитров охлажденной, но жидкой агарозы с низкой температурой плавления 2% и буфера Е3 с мягким перемешиванием. Используйте одномиллиметровый стеклянный капилляр с плунжером из PTFE, чтобы втянуть эмбрионы, внедренные в агарозу, в капилляр и дайте агарозе затвердеть в течение 30-60 секунд при комнатной температуре. Затем поместите капилляр в стакан с буфером E3, дополненным трикаином.
Чтобы настроить световой микроскоп для визуализации эмбриона, поместите капилляр в держатель капиллярного образца и щелкните металлическую оболочку в центре металлического диска держателя. Поместите две резиновые пробки в оболочку с прорезями, обращенными к концам оболочки, и проведите капилляром через середину резиновых пробок. Как только маркер окажется у основания металлической оболочки, используйте металлический колпачок, чтобы закрепить капилляр на месте и поместить держатель на верхнюю часть микроскопа с выровненными белыми метками.
Закройте крышку держателя образца и нажмите кнопку «Найти капилляр» в программном интерфейсе микроскопа. С помощью панели управления Ergo Drive переместите капилляр чуть выше цели. После открытия крышки осторожно нажмите поршень до тех пор, пока участок агарозы, содержащий эмбрион, не будет висеть ниже дна капилляра перед объективом.
Выключите функцию «Найти капилляр» и щелкните «Найти образец», чтобы переключить вид с веб-камеры камеры образца на объектив микроскопа, и используйте это представление для более точной настройки положения образца. Затем отключите образец поиска и перейдите на вкладку сбора. Установите флажки z-стек и временные ряды.
В окне параметров режима получения выберите настройку двухстороннего светового листа и установите флажки для онлайн-сканирования двухстороннего слияния и поворота. Щелкните непрерывно, чтобы получить представление эмбриона в реальном времени. В окне канала выберите канал 488 и установите мощность лазера на единицу, а время экспозиции на 7,5 миллисекунд.
Используйте панель управления Ergo Drive для регулировки положения эмбриона до тех пор, пока поле глаз не окажется непосредственно лицом к камере, и отрегулируйте параметры левого и правого индикаторов в каналах до тех пор, пока поле глаза не окажется достаточно сфокусированным. Установите первую и последнюю z-позиции примерно на 500 микрометров от последнего обнаруживаемого флуоресцентного сигнала и нажмите «Оптимальный», чтобы установить размер шага на 0,477 микрометра. Чтобы установить параметры инкубации, установите флажок для блока Пельтье, чтобы поддерживать температуру на уровне 28 градусов по Цельсию.
В окне временных рядов выберите соответствующую экспериментальную частоту и временной интервал для получения изображений. Нажмите кнопку Начать эксперимент. Выберите папку для сохранения набора изображений и задайте префикс изображения, затем нажмите кнопку Сохранить, чтобы запустить образ.
Для анализа изображений импортируйте файлы изображений в соответствующую программу для анализа 4D-изображений и щелкните куб 4D-средства просмотра, шкалу масштаба и значок видео, чтобы открыть панель задач раскадровки. Выберите Добавить последовательность ключевых кадров и укажите продолжительность видео в секундах. Снимите флажок Создать поворот и установите флажок Использовать прогрессию времени, чтобы включить определенные временные точки в видео.
Сохраните раскадровку, чтобы применить одни и те же параметры к нескольким наборам изображений. Нажмите «Экспортировать фильм», чтобы сохранить видео с замедленной съемкой и указать параметры экспорта фильма, включая имя и местоположение файла, формат видео, разрешение видео, частоту кадров, разрешение данных. При необходимости добавьте метки времени и выберите запись.
Чтобы создать видео поворота в определенные моменты времени, добавьте последовательность ключевых кадров, как только что было продемонстрировано, но установите флажок Создать поворот и снимите флажок Использовать прогрессию времени. Чтобы отобразить изображение с высоким разрешением в любой ориентации и в любой отдельной точке времени, выберите значок камеры в 4D-средстве просмотра. Чтобы построить конвейер для анализа, выберите flask для доступа к панели анализа и откройте меню операций анализа, чтобы выбрать последовательность интересующих операций.
Щелкните синий треугольник, чтобы запустить конвейер. В конце выполнения щелкните столбцы компонентов во всплывающем окне, чтобы просмотреть список объектов, которые могут предоставить информацию об интересующем объекте, а затем нажмите кнопку Экспорт, чтобы экспортировать данные в электронную таблицу. В этом репрезентативном анализе трансгенный эмбрион rx3: GFP был изображен с точки зрения спины каждые пять минут от стадии одного сомита до 24 часов после оплодотворения в общей сложности 14 часов.
Как было замечено, выполнение конвейерного запуска изображений, полученных из этого анализа, облегчило генерацию маски развивающегося глаза. Обратите внимание, что когда глазное поле разделено на две зрительные везикулы, может наблюдаться третья положительная область rx3: GFP в переднем мозге, которая способствовала гипоталамусу. Эта информация также наблюдалась в объемных данных и может быть легко отделена от данных оптических пузырьков, поскольку она была намного меньше по объему, чем наблюдалась для любого оптического везикла.
Эта процедура может сопровождаться дополнительным анализом, например, отслеживанием отдельных ячеек по всему набору данных изображения.
