Nosso protocolo fornece informações visuais e em tempo real sobre como o processo de morfogênese ocular ocorre em condições normais e patológicas. Nosso protocolo permite a rápida aquisição de pilhas z, o que diminui o tempo entre cada imagem 3D no conjunto de dados. Isso fornece uma resolução temporal aumentada de como a morfogênese ocular ocorre.
Posicionar o embrião dentro do capilar pode ser desafiador devido à sua forma esférica no estágio único de somite, por isso é importante carregar vários embriões no capilar para garantir que pelo menos um esteja na orientação correta. Para testar a presença de somites em 10 horas após a fertilização, coloque os embriões sob um microscópio estéreo e use um adaptador de fluorescência para confirmar a presença do transgene rx3:GFP. Uma vez identificados três a cinco embriões de sarampo únicos positivos do GFP, use fórceps finos para decorionar os embriões.
Para incorporar os embriões em agarose, transfira os embriões para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microliters de tampão de embrião E3 suplementado com 168 microgramas por mililitro de tricaine e adicione 500 microliters de agarose de temperatura de fusão fria, mas líquida 2% baixa e tampão E3 ao tubo com mistura suave. Use um capilar de vidro de um milímetro com um êmbolo PTFE para puxar os embriões embutidos na agarose no capilar e deixar a agarose solidificar por 30 a 60 segundos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o capilar em um béquer de tampão E3 suplementado com tricaína.
Para configurar um microscópio de folha de luz para imagem de embrião, coloque o capilar no suporte de amostra capilar e clique na baála em metal no centro do disco metálico do suporte. Coloque duas rolhas de borracha na bainha com as fendas voltadas para as extremidades da bainha e deslize o capilar pelo meio das rolhas de borracha. Uma vez que o marcador esteja na base da bainha metálica, use a tampa metálica para fixar o capilar no lugar e coloque o suporte na parte superior do microscópio com as marcas brancas alinhadas.
Feche a tampa do suporte de amostra e clique no botão localizar capilar na interface do software do microscópio. Usando o painel de controle Ergo Drive, mova o capilar para um pouco acima do objetivo. Depois de abrir a tampa, empurre suavemente o êmbolo até que a seção da agarose contendo o embrião esteja pendurada abaixo do fundo capilar na frente do objetivo.
Desligue a localização capilar e clique em localizar amostra para alternar a visualização da webcam da câmara de amostra para o objetivo do microscópio e use esta visualização para ajustar a posição da amostra com mais precisão. Em seguida, desligue a amostra de localização e mude para a guia de aquisição. Verifique as caixas z-stack e séries temporentas.
Na janela de parâmetros do modo de aquisição, selecione a configuração da folha de luz lateral dupla e verifique as caixas para fusão lateral dupla e digitalização de pivô on-line. Clique em contínuo para obter uma visão ao vivo do embrião. Na janela do canal, selecione 488 canais e defina a potência laser para um e o tempo de exposição a 7,5 milissegundos.
Use o painel de controle Ergo Drive para ajustar a posição do embrião até que o campo ocular fique diretamente voltado para a câmera e ajuste as folhas de luz esquerda e direita nos parâmetros dos canais até que o campo ocular esteja suficientemente em foco. Defina a primeira e última posição z em torno de 500 micrômetros além do último sinal fluorescente detectável e clique no ideal para definir o tamanho da etapa para 0,477 micrômetros. Para definir os parâmetros de incubação, verifique a caixa para a unidade Peltier para manter a temperatura em 28 graus Celsius.
Na janela da série temporal, selecione a frequência experimental apropriada e o intervalo de tempo para adquirir as imagens. Clique no experimento iniciar. Selecione a pasta para salvar o conjunto de imagens e defina o prefixo da imagem e clique em salvar para iniciar a imagem.
Para análise de imagem, importe os arquivos de imagem em um programa de software de análise de imagem 4D apropriado e clique no cubo de visualização 4D, na barra de escala e no ícone de vídeo para abrir a barra de tarefas do storyboard. Selecione adicionar sequência de quadro de teclas e especifique a duração do vídeo em segundos. Desmarque a caixa de rotação de criação e verifique a progressão de tempo de uso para incluir pontos de tempo específicos no vídeo.
Salve o storyboard para aplicar os mesmos parâmetros em vários conjuntos de imagens. Clique em exportar filme para salvar um vídeo da imagem timelapse e especifique as configurações de exportação de filme, incluindo o nome do arquivo e localização, formato de vídeo, resolução de vídeo, taxa de quadros, resolução de dados. Adicione os horários se desejar e selecione o registro.
Para criar vídeos de rotação em pontos de tempo específicos, adicione uma sequência de quadro-chave como apenas demonstrado, mas verifique a caixa de rotação de criação e desmarque a caixa de progressão de tempo de uso. Para renderizar uma imagem de alta resolução em qualquer orientação e em qualquer ponto de tempo individual, selecione o ícone da câmera no visualizador 4D. Para construir um pipeline para análise, selecione frasco para acessar o painel de análise e abra o menu de operações de análise para selecionar a sequência de operações de interesse.
Clique no triângulo azul para iniciar o oleoduto. No final da execução, clique em colunas de recursos na janela pop-up para visualizar uma lista dos recursos que podem fornecer informações sobre o objeto de interesse e, em seguida, clique em exportar os dados para uma planilha. Nesta análise representativa, um embrião transgênico rx3:GFP foi imageado do ponto de vista dorsal a cada cinco minutos do estágio de somite até 24 horas após a fertilização por um total de 14 horas.
Como observado, a realização de um pipeline das imagens capturadas a partir desta análise facilitou a geração de uma máscara do olho em desenvolvimento. Observe que quando o campo ocular é separado em duas vesículas ópticas, uma terceira região rx3:GFP positiva no cérebro que contribuiu para o hipotálamo pode ser observada. Essas informações também foram observadas nos dados de volume e podem ser facilmente separadas dos dados de vesícula óptica, pois eram muito menores em volume do que as observadas para qualquer vesícula óptica.
Este procedimento pode ser acompanhado com análises adicionais, por exemplo, o rastreamento de células individuais através do conjunto de dados de imagem.
