Protokolümüz, oküler morfogenez sürecinin hem normal hem de patolojik koşullar altında nasıl gerçekleştiği hakkında hem görsel hem de gerçek zamanlı bilgi sağlar. Protokolümüz, veri kümesindeki her 3B görüntü arasındaki süreyi azaltan z-yığınlarının hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Bu, oküler morfogenezin nasıl oluştuğuna dair artmış bir zamansal çözünürlük sağlar.
Embriyoyu kılcal damar içinde konumlandırmak, tek somit aşamasındaki küresel şekli nedeniyle zor olabilir, bu nedenle en az birinin doğru yönde olduğundan emin olmak için kılcal damara birden fazla embriyo yüklemek önemlidir. Döllenmeden 10 saat sonra somitlerin varlığını taramak için, embriyoları stereo mikroskop altına yerleştirin ve rx3: GFP transgeninin varlığını doğrulamak için bir floresan adaptörü kullanın. Üç ila beş GFP pozitif tek somit embriyo tanımlandıktan sonra, embriyoları süslemek için ince forseps kullanın.
Embriyoları agaroza gömmek için, embriyoları mililitre trikain başına 168 mikrogram ile desteklenmiş 500 mikrolitre E3 embriyo tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 500 mikrolitre soğutulmuş ancak% 2 düşük erime sıcaklığı agarozu ve E3 tamponunu nazik karıştırma ile tüpe ekleyin. Agaroz gömülü embriyoları kılcal damara çekmek için PTFE pistonlu bir milimetre cam kılcal damar kullanın ve agarozun oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye boyunca katılaşmasına izin verin. Daha sonra kılcal damarı trikain takviyeli E3 tamponundan oluşan bir beherin içine yerleştirin.
Embriyo görüntüleme için bir ışık tabakası mikroskobu kurmak için, kılcal damarı kılcal numune tutucuya yerleştirin ve tutucunun metal diskinin ortasındaki metal kılıfı tıklayın. Yarıklar kılıfın uçlarına bakacak şekilde kılıfın içine iki lastik tıpa yerleştirin ve kılcal damarı kauçuk tıpaların ortasından kaydırın. İşaretleyici metal kılıfın tabanına geldiğinde, kılcal damarı yerine sabitlemek için metal kapağı kullanın ve tutucuyu beyaz işaretler hizalanmış olarak mikroskopun üstüne yerleştirin.
Numune tutucunun kapağını kapatın ve mikroskop yazılım arayüzündeki kılcal damarı bul düğmesine tıklayın. Ergo Drive kontrol panelini kullanarak kılcal damarı hedefin hemen üstüne getirin. Kapağı açtıktan sonra, embriyoyu içeren agaroz bölümü, hedefin önündeki kılcal tabanın altında asılı olana kadar pistonu yavaşça itin.
Kılcal damarı bul'u kapatın ve görünümü örnek haznesi web kamerasından mikroskop hedefine geçirmek için örneği bul'u tıklatın ve numunenin konumunu daha hassas bir şekilde ayarlamak için bu görünümü kullanın. Ardından örneği bul'u kapatın ve edinme sekmesine geçin. Z-stack ve zaman serisi kutularını işaretleyin.
Alma modu parametreleri penceresinde, çift taraflı ışık sayfası ayarını seçin ve çevrimiçi çift taraflı füzyon ve pivot tarama kutularını işaretleyin. Embriyonun canlı görüntüsünü elde etmek için sürekli tıklayın. Kanalın penceresinde 488 kanal seçin ve lazer gücünü bire ve pozlama süresini 7,5 milisaniyeye ayarlayın.
Göz alanı doğrudan kameraya bakana kadar embriyonun konumunu ayarlamak için Ergo Drive kontrol panelini kullanın ve göz alanı yeterince odaklanana kadar kanal parametrelerindeki sol ve sağ ışık tabakalarını ayarlayın. İlk ve son z-konumlarını son algılanabilir floresan sinyalinin yaklaşık 500 mikrometre ötesine ayarlayın ve adım boyutunu 0,477 mikrometreye ayarlamak için en uygunu tıklayın. Kuluçka parametrelerini ayarlamak için, sıcaklığı 28 santigrat derecede tutmak için Peltier ünitesinin kutusunu işaretleyin.
Zaman serisi penceresinde, görüntüleri elde etmek için uygun deneysel frekansı ve zaman aralığını seçin. Denemeyi başlat'ı tıklayın. Görüntü kümesinin kaydedileceği klasörü seçin ve görüntü önekini ayarlayın, sonra görüntülemeyi başlatmak için Kaydet'i tıklayın.
Görüntü analizi için, görüntü dosyalarını uygun bir 4B görüntü analizi yazılımı programına aktarın ve film şeridi görev çubuğunu açmak için 4B görüntüleyici küpü, ölçek çubuğu ve video simgesini tıklatın. Anahtar kare sırası ekle'yi seçin ve videonun süresini saniye cinsinden belirtin. Döndürme oluştur kutusunun işaretini kaldırın ve videoya belirli zaman noktalarını dahil etmek için zaman ilerlemesini kullan seçeneğini işaretleyin.
Aynı parametreleri birden çok görüntü kümesine uygulamak için film şeridini kaydedin. Zaman atlamalı görüntülemenin bir videosunu kaydetmek için filmi dışa aktar'ı tıklatın ve dosya adı ve konumu, video biçimi, video çözünürlüğü, kare hızı, veri çözünürlüğü dahil olmak üzere film dışa aktarma ayarlarını belirtin. İsterseniz zaman damgaları ekleyin ve kaydı seçin.
Belirli zaman noktalarında döndürme videoları oluşturmak için, az önce gösterildiği gibi bir ana kare dizisi ekleyin, ancak döndürme oluştur kutusunu işaretleyin ve zaman ilerlemesini kullan kutusunun işaretini kaldırın. Herhangi bir yönde ve herhangi bir zaman noktasında yüksek çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için 4B görüntüleyicide kamera simgesini seçin. Analiz için bir işlem hattı oluşturmak üzere şişeyi seçerek analiz paneline erişin ve ilgilenilen işlemlerin sırasını seçmek için analiz işlemleri menüsünü açın.
İşlem hattını başlatmak için mavi üçgeni tıklatın. Çalıştırmanın sonunda, ilgilenilen nesne hakkında bilgi sağlayabilecek özelliklerin listesini görüntülemek için açılır pencerede özellik sütunlarını tıklayın, sonra verileri bir e-tabloya dışa aktarmak için dışa aktar'ı tıklayın. Bu temsili analizde, transgenik bir rx3: GFP embriyosu, bir somit aşamasından döllenmeden sonraki 24 saat boyunca toplam 14 saat boyunca her beş dakikada bir dorsal görüş noktasından görüntülendi.
Gözlemlendiği gibi, bu analizden yakalanan görüntülerin boru hattı çalışmasının gerçekleştirilmesi, gelişmekte olan gözün maskesinin oluşturulmasını kolaylaştırdı. Göz alanı iki optik veziküle ayrıldığında, ön beyinde hipotalamusa katkıda bulunan üçüncü bir rx3: GFP pozitif bölgesinin gözlenebileceğini unutmayın. Bu bilgi hacim verilerinde de gözlenmiştir ve optik vezikül verilerinden kolayca ayrılabilir, çünkü hacim olarak her iki optik vezikül için gözlemlenenden çok daha küçüktür.
Bu yordam, görüntü veri kümesindeki tek tek hücreleri izleme gibi ek analizlerle takip edilebilir.
