Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Technik, mit der das Vorhandensein und die Länge von Glykosaminoglykanen, die Moleküle von zunehmend anerkannter Bedeutung für viele biologische Prozesse sind, nachgewiesen und gemessen werden kann. Diese Technik ist leicht an die meisten Life-Science-Labore anpassbar. Vergleichbare glykomische Techniken erfordern oft Ausrüstung und Fachwissen, die nur in glykochemischen Forschungslabors zu finden sind.
Diese Technik kann besonders nützlich für Forscher sein, die daran interessiert sind, den Glykokalyx zu untersuchen, eine Polysaccharidschicht, die die Endothel- und Epitheloberflächen des menschlichen Körpers ausknurpt. Beginnen Sie, indem Sie eine leere Kassette in den PAGE-Tank legen. Gießen Sie ein auflösendes Gel, indem Sie 10 Milliliter auflösende Gellösung mit 60 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.
Dann fügen Sie 10 Mikroliter TEMED hinzu. Kehren Sie das Rohr zwei- bis dreimal vorsichtig um. Schnell 10 Milliliter der aktivierten Polyacrylamid-Gellösung mit einer Pipette in die Kassette geben.
Mit zwei Millilitern entionisiertem gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen. Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser. Gießen Sie das Stapelgel, indem Sie drei Milliliter Stapelgellösung mit 90 Mikrolitern frisch zubereitetem 10% Ammoniumpersulfat in einem 15-Milliliter-Röhrchen mischen.
Dann fügen Sie drei Mikroliter TEMED hinzu und kehren Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal vorsichtig um. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das erstarrte auflösende Gel zu geben, bis die Kassette bis zum Rand gefüllt ist. Setzen Sie den mit der leeren Polyacrylamid-Gelkassette gelieferten Kamm vollständig ein und lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten lang polymerisieren.
Sobald das Gel polymerisiert ist, entfernen Sie den Bandstreifen vom Boden der Kassette und legen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe. Füllen Sie die obere und untere Kammer mit den jeweiligen Pufferlösungen. Lösen Sie getrocknete Glykosaminoglykanproben in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem gefiltertem Wasser auf und mischen Sie sie mit dem Probenladepuffer in einem Verhältnis von eins zu eins.
Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharidleitern in das Gel. Führen Sie das Gel fünf Minuten lang bei 100 Volt vor und führen Sie es dann mit 200 Volt für 20 bis 100 Minuten aus, abhängig vom Acrylamidanteil der auflösenden Gellösung. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel vorsichtig in einen großen, sauberen Behälter, der mit entionisiertem gefiltertem Wasser gefüllt ist.
Dann entsorgen Sie das Wasser und färben Sie das Gel fünf Minuten lang in Alcian Blau färben. Entsorgen Sie den Alcian-Blaufleck und waschen Sie ihn schnell zwei- bis dreimal mit entionisiertem gefiltertem Wasser, bis der größte Teil der Alcian-Blaufärbungslösung entfernt wurde. Das Gel in Silbernitrat-Färbelösung in einem frischen, sauberen Behälter für 30 Minuten einfärben.
Anschließend zwei- bis dreimal für jeweils 30 Minuten in entionisiertem gefiltertem Wasser waschen, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen. Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie die entwicklungspenstige Lösung hinzu. Beobachten Sie das Gel sorgfältig auf das Auftreten von Bändern.
Abhängig von der Qualität des Flecks und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten dauern. Sobald die gewünschten Bänder sichtbar sind, entsorgen Sie sofort die sich entwickelnde Lösung und waschen Sie das Gel kurz mit STOP-Lösung. Die isolierten und gereinigten Glykosaminoglykane wurden mit alcianblauer und silberner Färbetechnik nach dichteabhängiger Auflösung durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese visualisiert.
Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, waren Heparansulfat-Oligosaccharide unterschiedlicher Polymerlängen mit diesem PAGE-basierten Ansatz leicht nachweisbar. Die Nachweisgrenze dieser Methode von nur 0,5 Mikrogramm zeigt, dass die Technik beim Nachweis von aus biologischen Proben isolierten und gereinigten Glykosaminoglykanen sehr empfindlich ist. Von den vier verschiedenen Heparinsulfat-Oligosacchariden, die mit dieser Methode visualisiert wurden, war unfraktioniertes Heparin am wenigsten leicht nachweisbar.
Aufgrund der Polydispersität von unfraktioniertem Heparin ist die Dichte jedes einzelnen Bandes aus dieser Probe niedriger als die Banden, die durch eine gleiche Masse gereinigter Heparin-Oligosaccharide erzeugt werden. Die Effizienz der Glykosaminoglykan-Reinigung aus flüssigen biologischen Proben wurde anhand von bronchoalveolären Lavage-Proben von Mäusen bewertet, die ursprünglich relativ geringe Konzentrationen von Glykosaminoglykanen enthielten. Darüber hinaus wurde der Erfolg dieser Technik mit Heparinsulfat demonstriert, das aus dem gesamten Lungenhomogenat isoliert wurde, was eine ausreichende Menge an isoliertem Heparinsulfat ergab, wobei die kleinsten Fragmente etwa 10 Disacchariduntereinheiten in der Masse entsprachen.
Es ist sehr wichtig, frisch zubereitete Reagenzien zu verwenden und jedes reagenz, das in diesem Protokoll verwendet wird, zu filtern. Es ist wichtig, Reagenzien von höchster Reinheit und Qualität zu verwenden, um diese Technik erfolgreich durchzuführen.
