Unser Protokoll ermöglicht die Erfassung der genetischen Verwandtheit zwischen primären und metastasierenden Läsionen durch die Identifizierung molekularer Veränderungen, die an der Krankheitsprogression beteiligt sind. Unsere Methode bietet die Möglichkeit, genetische Verwandtschaft in klinischen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu erforschen. Dies ist auf die Integration molekularer und histopathologischer Analysen zurückzuführen.
Die Beurteilung der Intratumorheterogenität im Bereich der Krebsforschung ist bei der Entwicklung wirksamer Anti-Tumor-Strategien von größter Bedeutung und unsere Methode ist allgemein auf viele solide Tumortypen anwendbar. Nach der Vorbereitung und Quantifizierung der interessierten Bibliotheken, verdünnen Sie jede Bibliothek auf eine Konzentration von 100 Picomolar in nukleasefreiem Wasser und kombinieren Sie 10 Mikroliter jeder verdünnten Bibliothek für einen einzigen Durchlauf in einem einzigen Rohr. Mischen Sie dann die gepoolten Bibliotheken durch Pipettieren.
Um eine Sequenzierungsausführung zu initiieren, öffnen Sie zuerst den Torrent-Browser auf einem Computer, der mit dem Sequenzierungssystem verbunden ist. Planen Sie eine neue Ausführung mit der generischen Vorlage für die ausgewählte Anwendung und wählen Sie unter der Registerkarte Kits Ion Proton System oder Ion Gene Studio S5 System aus. Wählen Sie den entsprechenden Chip aus dem Dropdown-Menü chip type aus und wählen Sie Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit aus der Dropdown-Liste des Bibliothekskits aus.
Wählen Sie die Schaltfläche "Ion Chef" für das Vorlagenkit aus, und wählen Sie das entsprechende Chef Kit aus der Dropdown-Liste des Vorlagenkits aus. Wählen Sie das entsprechende Sequenzierungskit aus dem Dropdown-Menü des Sequenzierungskits aus, und wählen Sie Ion Express aus der Dropdown-Liste Barcode-Set aus. Wählen Sie unter der Registerkarte Plugin das Coverage-Analyse-Plugin aus.
Wählen Sie unter der Registerkarte Plan das Genom GRCH37HG19 aus der Dropdown-Liste der Referenzbibliothek aus. Wählen Sie aus der Dropdown-Liste Zielregionen das entsprechende Bedienfeld aus, das sequenziert werden soll. Legen Sie dann die Anzahl der zu sequenzierenden Barcodes fest, und legen Sie den Barcodenamen und den Beispielnamen für jede Bibliothek fest.
Für eine gepoolte Bibliothekverdünnung die Bestandsbibliothek mit nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 25 Picomolar für einen Ionenprotonenchip und eine Pipette 50 Mikroliter jeder verdünnten Bibliothek bis zum Boden des entsprechenden Bibliotheksprobenrohrs verdünnen. Laden Sie Probenröhrchen mit den gepoolten verdünnten Bibliotheken auf das Bibliotheksvorbereitungssystem und starten Sie die klonale Verstärkung. Befolgen Sie bei der Sequenzierung der nächsten Generation die Anweisungen auf dem Bildschirm, um das Instrument zu initialisieren.
Wenn die klonale Verstärkung abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ion Chef Instrumententür, öffnen Sie dann den Deckel der Spanladezentrifuge und entfernen Sie die beiden Chips aus dem Bibliotheksvorbereitungssystem. Legen Sie die Chips in separate Chip-Lagerbehälter und laden Sie einen der Chips in das Chipfach im Instrument. Schließen Sie dann den Spanfachdeckel und starten Sie die Sequenzierung.
Öffnen Sie für die Mutationsanalyse das Coverage-Analyse-Plugin, und verwenden Sie die Ausgabe der Abdeckungsanalyse, um die Tiefe der Abdeckung und Homogenität zu überprüfen. Verwenden Sie das Torrent Variant Caller Plugin, um die Variante auszuführen, die die Keimbahn oder den somatischen Workflow entsprechend auswählt. Laden Sie dann gefilterte Varianten Variantenaufrufformatdateien herunter und verwenden Sie die Varianteneffektvorhersagesoftware in der NCBI RefSeq-Datenbank, um die Varianten zu kommentieren.
Um die Variationen der Kopiernummer zu schätzen, verwenden Sie das Ion Reporter Uploader-Plugin, um die Sequenzierungsdaten in die Ion Reporter-Software zu laden und den umfassenden Workflow für Tumor-Tumor-Normale Paar für Krebsplatten zu verwenden, um die Daten zu analysieren. Filtern Sie die Mutationen und Kopiernummernvariationen manuell anhand der von der Software zugewiesenen Partituren und überprüfen Sie die Variationen visuell mit dem Integrativen Genomics Viewer. Überprüfen Sie dann visuell die Ausrichtung auf ungewöhnliche Lesevorgänge, die Artefaktaufrufe generieren können, und überprüfen Sie die normalisierte Abdeckung für alle Amplicons in einem bestimmten Gen mit der normalisierten Abdeckung der Baseline, um die Variationen der Kopiernummer zu überprüfen.
In jedem Fall werden die Mutationsaufrufe aus der Sequenzierung von normalem Gewebe oder Blut oder Primärtumor oder Metastasierung indiziert. Flagge als Keimbahn und Wegwerfrufe, die auch aus den Sequenzierungsdaten der Keimbahn-DNA ersichtlich sind. Flagge als klonal oder Gründer der Mutationen, die unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten geteilt werden.
Dann Kennzeichnen Sie als subklonal oder progressor die Mutationen, die in einigen, aber nicht allen Läsionen eines bestimmten Patienten erkannt werden. In diesem repräsentativen Experiment identifizierte die Multi-Lesion-Sequenzierung von fünf soliden pseudopapillaren Neoplasma-Fällen, die auf die Kodierungssequenzen von 409 krebsbedingten Genen abzielten, insgesamt 27 somatische Mutationen in acht Genen. Mutationen wurden als Gründer oder Klonal definiert, wenn sie unter allen Läsionen eines bestimmten Patienten und Progressor oder subklonal geteilt wurden, wenn sie bei einigen, aber nicht allen Läsionen eines bestimmten Patienten nachgewiesen wurden.
Konsequenterweise war die immunhistochemische Färbung für Beta-Catenin und KMD6A unter den verschiedenen Läsionen von Fällen mit Mutationen der entsprechenden Gene homogen. Die moderate Färbung von KMD6A in mutierten Proben deutet darauf hin, dass genetische Veränderungen eher die Funktion als die Expression des Proteins verändern. KMD6A Funktionsverlust bei Bauchspeicheldrüsentumoren ist mit einer Up-Regulierung des Hypoxie-Markers GLUT-1 verbunden.
Und dementsprechend wurde GLUT-1 in Fällen mit KMD6A-Mutationen überdrüsslich ausgedrückt. Die Immunhistochemie für BAP1 und TP53 bestätigte, dass Mutationen in diesen Genen subklonal waren. In diesem virtuellen Karyotyp eines repräsentativen Falles, der den Standort, die Nähe und den Kopiernummernstatus veränderter Gene zeigt, ergab die Kopiernummernvariationsanalyse anhand von Sequenzierungsdaten Veränderungen in allen analysierten Proben.
Und im Gegensatz zu Punktmutationen waren die meisten Änderungen der Kopierzahlvariationen subklonal. Die Validierung und Indexierung von Mutationen und Variationen der Kopiernummer sowie die Verwendung des tumornormalen DNA-Vergleichs sind wichtig, um die Generierung von Artefaktaufrufen zu vermeiden, die die Ergebnisse ungültig machen könnten. Dieses Verfahren könnte auch auf ganze Genomsequenzierungsstudien angewendet werden, die darauf abzielen, das gesamte Genom zur Identifizierung der Mutation zwischen der Läsion verschiedener solider Tumortypen zu verhören.
Im Bereich der Krebsforschung sind diese Techniken wichtige Werkzeuge für das Verständnis der Biologie von Krankheiten mit wichtigen klinischen Implikationen, die auf die Entwicklung personalisierter und effektiver zielgerichteter Therapien abzielen.
